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HDGF fördert die Gefitinib-Resistenz, indem es die PI3K/AKT- und MEK/ERK-Signalwege in nicht aktiviert

Dec 22, 2023

Cell Death Discovery Band 9, Artikelnummer: 181 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Die Expression des Hepatom-Wachstumsfaktors (HDGF) ist mit einer schlechten Prognose bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) verbunden; Ob HDGF die Gefitinib-Resistenz bei NSCLC beeinflusst, bleibt jedoch unbekannt. Ziel dieser Studie war es, die Rolle von HDGF bei der Gefitinib-Resistenz bei NSCLC zu untersuchen und die zugrunde liegenden Mechanismen zu entdecken. Für die Durchführung von Experimenten in vitro und in vivo wurden stabile HDGF-Knockout- oder Überexpressionszelllinien generiert. HDGF-Konzentrationen wurden mit einem ELISA-Kit bestimmt. Die Überexpression von HDGF verschlimmerte den malignen Phänotyp von NSCLC-Zellen, während die HDGF-Knockdown den gegenteiligen Effekt hatte. Darüber hinaus wurden PC-9-Zellen, die anfänglich Gefitinib-empfindlich waren, nach einer HDGF-Überexpression resistent gegen die Gefitinib-Behandlung, wohingegen HDGF-Knockdown die Gefitinib-Empfindlichkeit in H1975-Zellen erhöhte, die anfänglich Gefitinib-resistent waren. Höhere HDGF-Spiegel im Plasma oder Tumorgewebe deuteten ebenfalls auf eine Gefitinib-Resistenz hin. Die Wirkung von HDGF auf die Förderung der Gefitinib-Resistenz wurde durch MK2206 (Akt-Inhibitor) oder U0126 (ERK-Inhibitor) weitgehend abgeschwächt. Mechanistisch löste die Behandlung mit Gefitinib die HDGF-Expression aus und aktivierte die Akt- und ERK-Signalwege, die unabhängig von der EGFR-Phosphorylierung waren. Zusammenfassend trägt HDGF zur Gefitinib-Resistenz bei, indem es die Akt- und ERK-Signalwege aktiviert. Die höheren HDGF-Werte lassen möglicherweise auf eine schlechte Wirksamkeit der TKI-Behandlung schließen und könnten daher als neues Ziel für die Überwindung der Tyrosinkinase-Inhibitor-Resistenz bei der Bekämpfung von NSCLC dienen.

Lungenkrebs ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache. Nichtkleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht etwa 80 % aller Lungenkarzinomfälle aus. Patienten mit Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) sprechen gut auf Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) an, aber alle ansprechenden Patienten entwickeln schließlich eine erworbene Resistenz gegen TKIs [1]. Zu den zugrunde liegenden Mechanismen der TKI-Resistenz gehören sekundäre Resistenzmutationen von Zielgenen, die Aktivierung von Bypass-Signalwegen, eine Fehlregulation nachgeschalteter Effektoren und eine phänotypische Transformation [2]. Die T790M-Mutation im Exon 20 des EGFR macht etwa 50 % der Resistenzfälle aus und ist der vorherrschende Resistenzmechanismus von TKIs. Allerdings sind etwa 19 % der Resistenzmechanismen noch unbekannt [3].

Hepatom-derived Growth Factor (HDGF) ist ein Heparin-bindender Wachstumsfaktor, der erstmals aus dem konditionierten Medium der Huh-7-Hepatom-Zelllinie identifiziert wurde [4], was darauf hinweist, dass er sezerniert werden kann. Es wurde berichtet, dass HDGF am Wachstum von Krebszellen, der Angiogenese, der Anti-Apoptose und der Tumormetastasierung beteiligt ist [4, 5]. Bei einer Reihe von Tumortypen, darunter NSCLC, Eierstockkrebs, Mundkrebs, Magenkrebs und Melanom, ist HDGF überexprimiert und seine höhere Expression korreliert stark mit einer schlechten Prognose [6,7,8,9,10,11]. HDGF verstärkt die vom vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) abhängige Angiogenese bei NSCLC [12], und hohe HDGF-Spiegel im Serum sagen eine Knochenmetastasierung und eine ungünstige Prognose bei NSCLC voraus [13]. Bei chirurgisch reseziertem NSCLC im Stadium I gilt HDGF als Biomarker für das molekulare Staging und die Prognose und liefert Vorhersagen für eine postoperative adjuvante Chemotherapie [14]. Die Hemmung von HDGF unterdrückte das Tumorzellwachstum sowohl in vitro als auch in vivo [15, 16]. Antikörper gegen HDGF könnten einen NSCLC-Rückfall nach einer Chemotherapie verhindern, indem sie Krebsstammzellen unterdrücken [17, 18]. Einige microRNAs (miRNAs) hemmen die NSCLC-Proliferation und -Invasion, indem sie auf HDGF abzielen [19,20,21]. Daher ist HDGF ein vielversprechendes potenzielles Ziel für die Behandlung von NSCLC.

Unser vorheriges Experiment hat gezeigt, dass Marsdenia tenacissima-Extrakt (MTE) die Resistenz gegen Gefitinib, einen weit verbreiteten TKI der ersten Generation, bei NSCLC in vitro und in vivo überwinden kann (22, 23). Unterdessen könnte MTE die Interaktion zwischen Tumor-assoziierten Makrophagen und NSCLC-Zellen stören, indem es auf HDGF abzielt [24]. Unsere vorläufige Studie zeigte, dass MTE in Kombination mit Gefitinib die HDGF-Expression in resistenten H1975-Zellen verringern kann, wie durch 2D-Gelelektrophorese in Verbindung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC‒MS/MS) und Western Blot nachgewiesen wurde (Abb. S1). ). Studien haben gezeigt, dass HDGF die Chemotherapieresistenz bei Darmkrebszellen und Plattenepithelkarzinomen der Zunge fördert [25, 26] und die Strahlenresistenz bei Brustkrebs fördert [27]. Die Rolle von HDGF bei der Gefitinib-Resistenz ist jedoch unklar. Obwohl ortsspezifische Peptidreporter und gezielte Massenspektrometrie darauf hindeuteten, dass HDGF-S165, ein synthetisches Substratpeptid, einen möglichen Zusammenhang mit der TKI-Resistenz haben könnte [28], gibt es keine direkten Beweise für einen Zusammenhang zwischen HDGF-Spiegeln und TKI-Wirksamkeit. In dieser Studie haben wir die Korrelation zwischen HDGF und Gefitinib-Resistenz in vitro und in vivo nachgewiesen und die komplementäre Wirkung zwischen HDGF und EGFR in NSCLC-Zellen identifiziert.

Durch 2D-Gel- und LC-MS/MS-Analysen wurde HDGF als eines der unterschiedlich exprimierten Proteine in H1975-Zellen identifiziert, die mit Gefitinib oder MTE allein oder in Kombination behandelt wurden (Abb. S1). Studien haben gezeigt, dass die HDGF-Expression als prognostischer Faktor bei Patienten mit NSCLC im Frühstadium angesehen wird [6]; HDGF fördert auch die Chemotherapieresistenz bei einigen Tumoren, darunter Darmkrebs, Plattenepithelkarzinom der Zunge und Brustkrebs [25,26,27]. Daher haben wir HDGF als Zielprotein für weitere Untersuchungen ausgewählt. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass HDGF nach Exposition gegenüber der kombinierten Behandlung mit Gefitinib und MTE im Vergleich zu jeder Einzelbehandlung und der Kontrollgruppe in H1975-Zellen signifikant herunterreguliert war (Abb. S1).

Um die Funktion von HDGF bei NSCLC besser zu verstehen, haben wir seine Expression in sieben NSCLC-Zelllinien mit unterschiedlichen Reaktionen auf Gefitinib nachgewiesen. Die Gefitinib-empfindlichen PC-9- und H292-Zellen wiesen eine relativ geringere HDGF-Expression auf, während H1975-Zellen sehr hohe HDGF-Werte exprimierten (Abb. S1). HDGF wurde durch das CRISPR/Cas9-System in H1975-Zellen abgebaut, während eine stabile HDGF-Überexpression durch Transfektion des HDGF plenti6-TR-Plasmids in PC-9- und H292-Zellen etabliert wurde. Die Überexpression oder der Abbau von HDGF wurde durch Western Blot und qRT-PCR validiert (Abb. 1A, 1B).

HDGF wurde durch das CRISPR/Cas9-System in H1975-Zellen abgebaut, während es in PC-9- und H292-Zellen durch Transfektion des plenti6-TR-Plasmids überexprimiert wurde. Die HDGF-Expression wurde durch Western Blot (A) und qRT‒PCR nachgewiesen. B Die Proliferation von NSCLC-Zellen mit unterschiedlichem Ausmaß an HDGF-Expression (C) oder stimuliert mit 5 ng rhHDGF (D) wurde nach 24, 48, 72 und 96 Stunden nachgewiesen. E Koloniebildungsfähigkeiten von NSCLC-Zellen mit unterschiedlichen HDGF-Expressionsniveaus. F Zeigt die Analyseergebnisse von E. G Die Migrations- und Invasionsfähigkeiten von HDGF-Knockdown-H1975-Zellen wurden durch den Transwell-Assay bestimmt. H Zeigt die Analyseergebnisse von (G). I Migrations- und Invasionsfähigkeiten wurden in HDGF-überexprimierenden PC-9- und H292-Zellen bestimmt. J zeigt die Analyseergebnisse von (I). Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment, das in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 vs. Kontrolle.

Um den Einfluss der HDGF-Spiegel auf die biologischen Eigenschaften von NSCLC-Zellen zu verstehen, haben wir Zellphänotypen nach HDGF-Knockdown oder Überexpression gemessen. Wie in Abb. 1 gezeigt, hemmten HDGF sgRNA1 und sgRNA2 H1975 signifikant die Zellproliferation (Abb. 1C), die Koloniebildung (Abb. 1E, F) sowie die Migrations- und Invasionsfähigkeiten (Abb. 1G, H) (P < 0,01, P < 0,001 vs. Kontrolle), was darauf hindeutet, dass der HDGF-Knockdown die bösartigen Eigenschaften von NSCLC-Zellen reduzierte. Im Gegensatz dazu wurde die Proliferation von H292- und PC-9-Zellen durch HDGF-Überexpression gefördert (Abb. 1C) oder mit rhHDGF stimuliert (Abb. 1D). Unterdessen verstärkte die Überexpression von HDGF die Koloniebildungs- (Abb. 1E, F) sowie die Migrations- und Invasionsfähigkeiten (Abb. 1I, J) von H292- und PC-9-Zellen (P < 0,01, P < 0,001 gegenüber der Kontrolle). Daher zeigten die obigen Daten, dass HDGF den malignen Phänotyp von NSCLC-Zellen förderte.

Wir haben den Zusammenhang zwischen HDGF und Tumorwachstum bei Xenotransplantatmäusen ermittelt. Wie in Abb. 2 gezeigt, wurde das Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrollgruppe durch beide HDGF-sgRNAs signifikant verringert (Abb. 2A–C), und die hemmende Wirkung war in der sgRNA2-Gruppe deutlicher, was darauf hindeutet, dass der HDGF-Knockdown die H1975-Tumorentwicklung einschränkte . Unterdessen bestätigte Western Blot, dass die HDGF-Expression durch beide sgRNAs in H1975-Tumorgeweben gehemmt wurde (Abb. 2D, E). Umgekehrt erhöhte die HDGF-Überexpression das Volumen und Gewicht des PC-9-Tumors im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich (Abb. 2F – H). Western-Blot-Assays bestätigten auch höhere HDGF-Spiegel in PC-9-Tumorgeweben (Abb. 2I, J). Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass HDGF das Tumorwachstum förderte, dass der Abbau von HDGF diesen Prozess jedoch einschränken könnte.

A Repräsentative Bilder von H1975-Xenotransplantat-Tumoren mit HDGF-Knockdown. B, C zeigen H1975-Xenotransplantat-Tumorvolumen und Tumorgewicht. D-HDGF-Proteinexpression in H1975-Maustumorgeweben. E Zeigt die Analyseergebnisse von (D). F Repräsentative Bilder von PC-9-Xenotransplantattumoren in Nacktmäusen mit HDGF-Überexpression. G, H zeigen PC-9-Xenotransplantat-Tumorvolumen und Tumorgewicht. I HDGF-Proteinexpression in Tumorgeweben von PC-9-Mäusen. J Zeigt die Analyseergebnisse von I. Die Expression von p-Akt und p-ERK in H1975- und PC-9-Zellen (K) oder Maustumorgeweben (L) mit HDGF-Knockdown oder Überexpression. M, N Zeigen Sie die Analyseergebnisse von (K, L). Die Überexpression von O, P HDGF oder das rhHDGF-induzierte H292- und PC-9-Zellwachstum wurde durch den Akt-Inhibitor MK2206 oder den ERK1/2-Inhibitor U0126 aufgehoben oder umgekehrt. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment, das in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 vs. Kontrolle.

Studien haben gezeigt, dass die EGFR-Downstream-Moleküle p-Akt und p-ERK abnormal aktiviert werden, wenn NSCLC eine Resistenz gegen Gefitinib ausübt [29]. In unserem Experiment wurden Veränderungen dieser beiden Moleküle in NSCLC-Zellen und Tumorgeweben von Mäusen festgestellt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte der HDGF-Knockdown zu einer drastisch verringerten p-Akt- und p-ERK-Expression in H1975-Zellen, und sgRNA2 zeigte eine stärkere Hemmwirkung. Im Gegensatz dazu erhöhte die HDGF-Überexpression die p-Akt- und p-ERK-Spiegel in H292- und PC-9-Zellen (Abb. 2K, M). In Maustumorgeweben stimmten die Veränderungen in p-Akt und p-ERK mit denen in den Zelllinien überein (Abb. 2L, N). In Gegenwart des Akt-Inhibitors MK2206 oder des ERK-Inhibitors U0126 wurde das durch HDGF-Überexpression oder rhHDGF in H292- und PC-9-Zellen induzierte verstärkte Wachstum aufgehoben oder umgekehrt (Abb. 2O, P).

Nachdem wir die Rolle von HDGF bei NSCLC verstanden hatten, untersuchten wir den Zusammenhang zwischen HDGF-Expression und der Wirksamkeit von Gefitinib weiter. Wie in Abb. 3A gezeigt, reagierte der HDGF-Knockdown durch sgRNAs in H1975-Zellen gut auf Gefitinib mit IC50-Werten von 2,21 μM bzw. 1,08 μM im Vergleich zu 7,30 μM in der sgRNA-Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu erhöhte HDGF die IC50-Werte von Gefitinib im Vergleich zu Gefitinib-empfindlichen H292- und PC-9-Elternzellen um das 17- bzw. 20-fache (Abb. 3B, C). Die Behandlung mit Gefitinib unterdrückte die Koloniebildung sowie die Migrations- und Invasionsfähigkeiten in HDGF-stummgeschalteten H1975-Zellen deutlich, übte jedoch nur geringfügige Einflüsse in der Kontrollgruppe aus (Abb. 3D, G, J, M). Umgekehrt verringerte die Behandlung mit Gefitinib die Koloniebildung (Abb. 3E, F, H, I) sowie die Migrations- und Invasionsfähigkeiten (Abb. 3K, L, N, O) von H292- und PC-9-Zellen, diese Hemmwirkungen wurden jedoch danach aufgehoben HDGF-Überexpression. Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass eine höhere HDGF-Expression mit einer Gefitinib-Resistenz verbunden sein könnte.

A–C H1975-, PC-9- und H292-Zellen wurden 72 Stunden lang mit 0,001–50 μM Gefitinib behandelt. Nach der Behandlung mit Gefitinib wurde die Fähigkeit zur Bildung von D-F-NSCLC-Zellkolonien festgestellt. G–I Zeigen Sie die Analyseergebnisse von D–F. J-L-NSCLC-Zellmigrations- und Invasionskapazitäten wurden nach 24-stündiger Gefitinib-Behandlung festgestellt. M–O Zeigen Sie die Analyseergebnisse von JL. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment, das in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 vs. Kontrolle.

Um die Korrelation zwischen HDGF und der Wirksamkeit von Gefitinib in vivo zu bewerten, führten wir Experimente an Mäusen durch, denen NSCLC-Zellen mit HDGF-Knockdown oder Überexpression implantiert wurden. Wie in Abb. 4A–C gezeigt, führte die Behandlung mit 50 mg/kg Gefitinib bei H1975-Xenotransplantaten nicht zu einer offensichtlichen Antitumorwirkung. Es verursachte jedoch eine signifikante Tumorverkleinerung in der HDGF-sgRNA2-Gruppe, was darauf hindeutet, dass der HDGF-Knockdown die Gefitinib-Empfindlichkeit verbesserte. Umgekehrt führte die stabile HDGF-Expression bei Gefitinib-empfindlichen PC-9-Xenotransplantaten zu einem schnellen Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrollgruppe, die tumorfördernde Wirkung von HDGF wurde jedoch durch die Verabreichung von 10 mg/kg Gefitinib abgeschwächt (Abb. 4D–F). Allerdings kam es sowohl in der HDGF-Überexpressions- als auch in der Kontrollgruppe zu einer Tumorregression, was möglicherweise auf die relativ hohe Dosierung von Gefitinib zurückzuführen ist, die in diesem Experiment verwendet wurde, da PC-9-Zellen sehr empfindlich auf Gefitinib reagieren. Dennoch führte die Überexpression von HDGF immer noch zu einem schnelleren Tumorwachstum als in der Kontrollgruppe nach der Behandlung mit Gefitinib beobachtet (P < 0,05), was darauf hindeutet, dass die HDGF-Augmentation die Wirksamkeit von Gefitinib in gewissem Maße aufhob. Wie in Abb. 4G gezeigt, zeigte die Ki-67- und HDGF-Expression in Maustumorgeweben ähnliche Muster wie Tumorvolumen und -gewicht in H1975- und PC-9-Xenotransplantaten.

NSCLC-Zellen wurden subkutan in Nacktmäuse geimpft, denen dann an den angegebenen aufeinanderfolgenden Tagen nach der Tumorbildung Gefitinib verabreicht wurde. Tumorvolumen, repräsentative Bilder von Tumoren und Tumorgewicht von HDGF-Knockdown-H1975-Xenotransplantaten, die mit 50 mg/kg Gefitinib (A–C) behandelt wurden, oder HDGF-überexprimierenden PC-9-Xenotransplantaten, die mit 10 mg/kg Gefitinib (D–F) behandelt wurden. G HDGF- und Ki-67-Expressionsniveaus in H1975- und PC-9-Tumorgeweben (20×). H-, I-Plasma-HDGF-Konzentrationen in H1975- und PC-9-Xenotransplantaten. J, K Plasma-HDGF-Konzentrationen bei NSCLC-Patienten vor der Einnahme von Gefitinib oder AZD9291 (einem TKI der dritten Generation) und nach Auftreten einer Arzneimittelresistenz. L, M Plasma-HDGF-Spiegel bei jedem Patienten vor und nach der Einnahme von Gefitinib oder AZD9291. N-HDGF-Expression in Biopsiegewebeproben, gemessen durch IHC vor der TKI-Behandlung und nach Fortschreiten der Krankheit. Patient Nr. 1 erhielt eine Behandlung mit Icotinib und Patient Nr. 2 verabreichte AZD9291. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. Kontrolle.

Da HDGF ein sekretorisches Protein ist, haben wir seine Konzentrationen im Plasma von Mäusen mit NSCLC-Tumoren bestimmt, um zu untersuchen, ob die Plasma-HDGF-Spiegel für die Wirksamkeit von Gefitinib relevant sind. Wie in Abb. 4H, I gezeigt, verlief die HDGF-Konzentration im Mausplasma parallel zur Wirksamkeit von Gefitinib. Wir haben außerdem vorläufig die Plasma-HDGF-Konzentrationen bei acht NSCLC-Patienten vor und nach der Einnahme von Gefitinib als Monotherapie analysiert. Wie in Abb. 4J, K gezeigt, waren im Vergleich zum Ausgangswert jeder der Fälle und ihre durchschnittlichen Plasma-HDGF-Spiegel offensichtlich erhöht, als eine Arzneimittelresistenz auftrat. Darüber hinaus haben wir die Plasma-HDGF-Konzentrationen bei fünf NSCLC-Patienten vor und nach der Behandlung mit AZD9291, einem TKI der dritten Generation, gemessen, bis sie eine Arzneimittelresistenz entwickelten. Die Ergebnisse ähnelten denen, die bei NSCLC-Patienten mit erworbener Gefitinib-Resistenz beobachtet wurden (Abb. 4L, M). Die HDGF-Expression wurde in gepaarten Biopsieproben vor und nach der TKI-Behandlung nachgewiesen. Spannend ist, dass HDGF in beiden Fällen, in denen eine TKI-Resistenz auftrat, stark exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass höhere HDGF-Werte eine schlechte Wirksamkeit der TKI-Behandlung vorhersagen könnten. Dennoch wurden in der vorliegenden Studie nur begrenzte Proben getestet und es sind weitere klinische Proben erforderlich, um dieses Ergebnis zu überprüfen.

Um die Mechanismen der HDGF-gesteuerten Gefitinib-Resistenz zu untersuchen, haben wir die mit der Gefitinib-Resistenz assoziierten Proteine p-Akt und p-ERK in NSCLC-Zellen (Abb. 5A) und Maustumorgeweben (Abb. 5B) bestimmt. Durch den HDGF-Knockdown wurde die p-Akt- und p-ERK-Expression deutlich reduziert, und dieser Effekt wurde durch Gefitinib weiter verstärkt, das allein die Akt- und ERK-Phosphorylierung in H975-Zellen erhöhte. Im Gegensatz dazu konnte Gefitinib, obwohl es p-Akt und p-ERK in H292- und PC-9-Zellen deutlich inhibierte, die durch HDGF-Überexpression verursachte erhöhte Akt- und ERK-Phosphorylierung nicht umkehren. Die oben genannten Daten bestätigten außerdem, dass die HDGF-Spiegel mit Signalen im Zusammenhang mit der Gefitinib-Resistenz verbunden waren.

Die Expression von p-Akt und p-ERK in NSCLC-Zellen (A) oder Xenotransplantat-Tumorgeweben (B) mit HDGF-Stilllegung oder Überexpression nach Gefitinib-Behandlung. C Zelllebensfähigkeit von PC-9-Zellen, die 24 Stunden lang mit 1 µM Gefitinib in Gegenwart von rhHDGF, MK2206 (Akt-Inhibitor, 0,5 µM) oder U0126 (ERK1/2-Inhibitor, 5 µM) behandelt wurden. D Das pcDNA3.1-EGFR T790M-Mutationsplasmid und der HDGF-Überexpressionsvektor allein oder zusammen wurden in die PC-9-Zelle eingeführt und dann 72 Stunden lang mit Gefitinib behandelt. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment, das in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. Kontrolle.

Frühere Ergebnisse zeigten, dass das HDGF-induzierte Zellwachstum durch Inhibitoren des Akt- oder ERK-Signalwegs aufgehoben oder umgekehrt wurde. In Abb. 5C haben wir MK2206 (einen Inhibitor von Akt) oder U0126 (einen Inhibitor von ERK) hinzugefügt, um zu validieren, ob HDGF die Gefitinib-Resistenz über diese beiden Signalwege fördert. Die Ergebnisse zeigten, dass die HDGF-Behandlung tatsächlich die Empfindlichkeit von PC-9-Zellen gegenüber Gefitinib verringerte; Allerdings wurden die verstärkenden Wirkungen von HDGF auf die Gefitinib-Resistenz durch MK2206 oder U0126 weitgehend abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass HDGF über den Akt- und ERK-Signalweg eine Gefitinib-Resistenz induzieren könnte.

Die EGFR-T790M-Mutation ist der primäre Mechanismus der Gefitinib-Resistenz. Um zu untersuchen, ob HDGF an der T790M-vermittelten Gefitinib-Resistenz beteiligt ist, wurden das pcDNA3.1-EGFR T790M-Mutationsplasmid und der HDGF-Überexpressionsvektor allein oder zusammen in die PC-9-Zellen eingeführt. In Abb. 5D zeigten unsere Ergebnisse, dass die T790M-Mutation oder die HDGF-Überexpression allein zu einer Gefitinib-Resistenz mit IC50-Werten von 0,107 µM bzw. 0,181 µM führten. Noch wichtiger: Wenn PC-9-Zellen sowohl einer T790M-Mutation als auch einer HDGF-Überexpression ausgesetzt waren, war die Gefitinib-Resistenz (IC50 = 0,253 µM) stärker erhöht als in den Zellen mit einer einzelnen T790M-Mutation oder HDGF-Überexpression. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch T790M-Mutation oder HDGF-Überexpression verursachte Gefitinib-Resistenz möglicherweise nicht denselben Mechanismus aufweist. Daher ist HDGF möglicherweise nicht an der durch die T790M-Mutation ausgelösten Gefitinib-Resistenz beteiligt.

Wir fanden heraus, dass die Stummschaltung oder Überexpression von HDGF die EGFR-Akt- und ERK-Aktivierung stromabwärts beeinflusste, was mit der TKI-Resistenz zusammenhängt. Dann fragten wir, ob zwischen HDGF und EGFR Crosstalk besteht. Zuerst durchsuchten wir Pathcards in der GeneCards-Datenbank (http://www.genecards.org) und stellten wenig überraschend fest, dass sich die meisten HDGF-Signalwege mit EGFR überlappten, einschließlich Akt- und ERK-Signalisierung (Abb. 6A). Als nächstes stellten wir fest, dass die p-EGFR-Spiegel umgekehrt mit dem Abbau oder der Überexpression von HDGF in NSCLC-Zellen und Tumorgeweben korrelierten (Abb. 6B, C). Gefitinib hemmte p-EGFR, steigerte HDGF jedoch dosisabhängig in getesteten NSCLC-Zellen, mit Ausnahme von H157-Zellen, die extrem niedrige p-EGFR- und HDGF-Expressionsniveaus aufweisen (Abb. 6D, E), was darauf hinweist, dass eine durch Gefitinib induzierte HDGF-Erhöhung nur bei EGFR-Zellen auftrat. abhängige NSCLC-Zellen. Parallel dazu waren auch die Konzentrationen von sekretiertem HDGF in den Überständen der getesteten NSCLC-Zellen mit Ausnahme von H157-Zellen nach der Behandlung mit Gefitinib erhöht (Abb. 6F).

A Die überlappenden Pfade zwischen HDGF und EGFR wurden aus der GeneCards-Datenbank abgerufen. Die EGFR-Expression wurde in NSCLC-Zellen (B) und Xenotransplantattumoren (C) mit HDGF-Knockdown oder Überexpression nachgewiesen. Die Expressionsniveaus von p-EGFR und HDGF wurden in NSCLC-Zelllinien (D) und mit Gefitinib behandelten NSCLC-Zellen für 24 Stunden (E) bestimmt. F HDGF-Konzentrationen in den Überständen von NSCLC-Zellen nach 24-stündiger Gefitinib-Behandlung. Veränderungen der HDGF- und p-EGFR-Expression in mit Gefitinib behandelten NSCLC-Zellen (G) und Xenotransplantat-Tumorgeweben (H) mit HDGF-Knockdown und Überexpression. I, J Zeigen die Analyseergebnisse von G, H. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment, das in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. Kontrolle.

Wir fragten dann, ob HDGF und EGFR komplementäre Rollen bei der Reaktion auf Gefitinib in NSCLC-Zellen mit HDGF-Verlust und -Zunahme spielen. Wie in Abb. 6G, I gezeigt, verursachte der Abbau von HDGF eine Abnahme der HDGF-Expression, und die Hochregulierung von p-EGFR wurde durch die Behandlung mit Gefitinib in H1975-Zellen rückgängig gemacht. In H292- und PC-9-Zellen führte die Überexpression von HDGF zu einer Erhöhung des HDGF und einer Unterdrückung von p-EGFR, und die Behandlung mit Gefitinib hemmte p-EGFR weiter, jedoch ohne offensichtlichen Einfluss auf die HDGF-Expression. Wie in Abb. 6H, J gezeigt, wurde HDGF durch die Verabreichung von Gefitinib in PC-9-Xenotransplantattumoren mit HDGF-Überexpression (P < 0,05) erhöht, und andere Veränderungen von HDGF und p-EGFR in Tumorgeweben stimmten mit den Zellexperimenten überein. Daher deuten die obigen Daten auf ein Übersprechen zwischen HDGF und EGFR bei NSCLC hin, und HDGF könnte als Bypass-Signalmolekül von EGFR dienen, um die nachgeschalteten Moleküle Akt und ERK zu aktivieren. Darüber hinaus spielen HDGF und EGFR komplementäre Rollen bei der Aufrechterhaltung des Überlebens von Tumorzellen, die Gefitinib ausgesetzt sind. Die Funktion von HDGF bei der Gefitinib-Resistenz wird durch ein schematisches Diagramm in Abb. 7 veranschaulicht.

Schematische Darstellung des Beitrags von HDGF zur Gefitinib-Resistenz durch Aktivierung nachgeschalteter EGFR-Moleküle als Bypass bei NSCLC.

In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass höhere HDGF-Spiegel nicht nur mit dem malignen Phänotyp von NSCLC verbunden sind, sondern auch eine Gefitinib-Resistenz induzieren können. TKI-Resistenz-bezogene Signalwege, wie die PI3K/Akt- und MEK/ERK-Signalwege, könnten durch HDGF auf EGFR-unabhängige Weise umgangen werden. Darüber hinaus erhöhte die Unterdrückung von HDGF die Wirksamkeit von Gefitinib in resistenten NSCLC-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo, was darauf hindeutet, dass HDGF ein potenzielles Ziel zur Überwindung der Gefitinib-Resistenz ist.

Erstens zeigte unsere Studie, dass HDGF die Entstehung von NSCLC-Tumoren förderte und die Metastasierung erleichterte. In H292- und PC-9-Zellen, die eine relativ geringe HDGF-Expression aufweisen, erhöhte die erzwungene HDGF-Expression die Proliferation, Koloniebildung sowie die Migrations- und Invasionsfähigkeiten der Zellen. Unterdessen verstärkte die exogene rhHDGF-Expression die Proliferation von H292- und PC-9-Zellen, was die Rolle von HDGF als Wachstumsstimulator bestätigte. Die Tumorentstehungsfunktion von HDGF wurde auch in HDGF-überexprimierenden PC-9-Xenotransplantatmäusen bestätigt. Im Gegensatz dazu hemmte die Stummschaltung von HDGF durch CRISPR den bösartigen Phänotyp von H1975-Zellen und verzögerte die Tumorentwicklung in vivo. Studien haben gezeigt, dass die gezielte Behandlung von HDGF durch miRNAs oder Antikörper das Wachstum von NSCLC [16, 19, 20, 21] oder Plattenepithelkarzinomen der Lunge wirksam hemmt [30]. Bisher konzentrierten sich die meisten Studien zu HDGF jedoch hauptsächlich auf seine tumorerzeugende Rolle, während der Bestimmung seiner Funktion bei der Resistenz gegen Krebstherapien nur begrenzte Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Wie berichtet, war HDGF an der Entwicklung der Chemotherapie-Arzneimittelresistenz bei Darmkrebs (25) und Plattenepithelkarzinomen der Zunge (26) beteiligt oder förderte die Strahlenresistenz bei Brustkrebs (27). Die Hemmung von HDGF mit dem Grüntee-Polyphenol (-)-Epigallocatechin-3-gallat (EGCG) könnte die Reaktion von NSCLC auf eine Chemotherapie verstärken [31].

Gefitinib ist ein häufig eingesetzter EGFR-TKI der ersten Generation für NSCLC-Patienten mit EGFR-empfindlichen Mutationen, doch unvermeidliche Arzneimittelresistenzen schmälern seinen klinischen Nutzen. Zu den wichtigsten Mechanismen, die für die TKI-Resistenz verantwortlich sind, gehören Veränderungen der Wirkstoffziele wie T790M, das die Hälfte aller Fälle erworbener Resistenz ausmacht, während die Aktivierung von Bypass-Signalen 20 bis 25 % aller Fälle ausmacht [32]. Allerdings gibt es immer noch etwa 15–20 % der NSCLC-Patienten, bei denen keine Mechanismen für eine erworbene TKI-Resistenz identifiziert wurden [29]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der HDGF-Knockdown die Gefitinib-Empfindlichkeit erhöhen könnte, während die HDGF-Erhöhung die Wirksamkeit von Gefitinib bei NSCLC in gewissem Maße aufhob. Im Detail hemmte der Abbau von HDGF das Tumorwachstum in H1975-Zellen in vitro und in vivo, während eine Überexpression von HDGF die Gefitinib-Reaktion in PC-9-Zellen verzögerte. Die immunhistochemische Färbung von Ki-67 und HDGF in Tumorgewebeschnitten von Mäusen stimmte mit den obigen Ergebnissen überein. Daher deuten unsere Daten darauf hin, dass die HDGF-Expression mit der Wirksamkeit von Gefitinib bei NSCLC korreliert. Diese Ergebnisse wurden teilweise durch eine aktuelle Studie gestützt, die über ortsspezifische Peptidreporter und gezielte Massenspektrometrie auf Nanogrammebene in Zellen einige Hinweise auf HDGF-S165- und TKI-Resistenz liefert [28].

Hohe HDGF-Spiegel im Serum waren ein Hinweis auf Knochenmetastasen und eine ungünstige Prognose bei NSCLC [13]. Erstens fanden wir eine parallele Korrelation zwischen den Plasma-HDGF-Spiegeln und der Antitumorwirkung von Gefitinib in NSCLC-Xenotransplantaten. In einer kleinen Anzahl klinischer Proben waren die HDGF-Spiegel auch im peripheren Blut von NSCLC-Patienten erhöht, die Gefitinib und AZD9291 einnahmen, nachdem eine Arzneimittelresistenz aufgetreten war. Unterdessen war die Überexpression von HDFG in klinischen Proben mit einer Gefitinib-Resistenz verbunden. Daher ist HDGF an der Gefitinib-Resistenz beteiligt, und die HDGF-Spiegel in Plasma- oder Gewebeproben können in gewissem Maße die Wirksamkeit von TKI vorhersagen. Allerdings wurden in der vorliegenden Studie nur begrenzte klinische Proben getestet; Daher sind mehr klinische Proben erforderlich, um diese Ergebnisse zu überprüfen.

PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Signalisierung sind wichtige EGFR-Downstream-Signalwege, die zur Zellproliferation führen. TKIs binden an die Tyrosinkinasedomäne von EGFR und blockieren die EGFR-gesteuerte Signalübertragung stromabwärts, um ihre tumorhemmende Wirkung auszuüben. Die EGFR-T790M-Mutation stört die Interaktion, indem sie ihre Affinität zu ATP erhöht, um Gefitinib-Resistenz zu verleihen [33]. Bei EGFR-unabhängigen Zuständen hat eine Fehlregulation anderer Rezeptortyrosinkinasen oder eine abnormale Aktivierung nachgeschalteter Signale eine kompensatorische Funktion zur Aufhebung der EGFR-Hemmung und führt zu einer TKI-Resistenz [3]. Der Bypass-Signalweg teilt die gleichen Downstream-Wege wie EGFR und konvergiert, um die Signalachsen PI3K/Akt und MAPK/ERK auszulösen [30, 34]. Eine große Anzahl von Studien hat eine fehlerhafte Aktivierung von p-Akt und p-ERK gezeigt, wenn eine EGFR-TKI-Resistenz auftritt [29], aber die Einschränkung der p-Akt- und p-ERK-Expression könnte die Gefitinib-Empfindlichkeit bei NSCLC wiederherstellen [35, 36]. In der vorliegenden Studie hemmte HDGF-Knockdown die Akt- und ERK-Phosphorylierung, während HDGF-Überexpression den gegenteiligen Effekt hatte, was darauf hindeutet, dass es die p-Akt- und p-ERK-Aktivierung reguliert. In Gefitinib-sensitiven NSCLC-Zellen wurden die durch Gefitinib eingeschränkten p-Akt- und p-ERK-Spiegel durch HDGF-Überexpression aufgehoben; In resistenten H1975-Zellen wurde die Aktivierung von Akt und ERK jedoch durch HDGF-Depletion stark unterdrückt. Akt- oder ERK-Inhibitoren wurden verwendet, um zu validieren, ob HDGF über diese beiden Wege Zellwachstum und Gefitinib-Resistenz induziert. Diese Daten deuten darauf hin, dass HDGF die EGFR-Downstream-p-Akt- und p-ERK-Signalisierung verstärken könnte, was mit der Gefitinib-Resistenz zusammenhängt.

Da sowohl EGFR als auch HDGF die Aktivierung von Akt und ERK regulieren, waren wir nicht überrascht, als wir bei der Suche in GeneCards (https://www.genecards.org) herausfanden, dass sich die meisten bekannten Pfade von HDGF mit EGFR überlappten, einschließlich der Akt- und ERK-Signalisierung ). Dies steht im Einklang mit einer Studie an Eierstockkrebszellen, in der extrazellulärer HDGF die Phosphorylierung von ERK stimulierte [37] und die Tumorentwicklung und -progression durch Regulierung des PI3K-Akt-Signalwegs in Blasenkrebszellen förderte [38]. Tumorzellen orchestrieren normalerweise ein Netzwerk von Signalwegen, um ihr Überleben aufrechtzuerhalten, wenn sie durch eine Krebstherapie mit dem Tod konfrontiert werden. Wenn der dominante Signalweg, wie z. B. EGFR, durch einen TKI gehemmt wird, neigen Tumorzellen dazu, den kritischen Downstream-Effektor über Bypass-Signalwege einzuschalten, wodurch das Überleben und Wachstum der Zellen fortgesetzt wird [39]. In der vorliegenden Studie stellten wir fest, dass die HDGF- und p-EGFR-Expressionsniveaus in NSCLC-Zellen mit oder ohne HDGF-Verlust und -Gewinn komplementär waren. Die Behandlung mit Gefitinib könnte die EGFR-Phosphorylierung verringern, aber die HDGF-Expression erhöhen, wodurch die PI3K/Akt- und MEK/ERK-Signalwege fehlerhaft aktiviert werden. Allerdings könnte der Abbau von HDGF in H1975-Zellen EGFR reaktivieren und HDGF verringern, wenn sie Gefitinib ausgesetzt werden, was sowohl auf ein empfindliches Gleichgewicht als auch auf eine Komplementarität zwischen HDGF und p-EGFR in EGFR-abhängigen NSCLC-Zellen hindeutet, wenn sie Gefitinib ausgesetzt werden. Unter Berücksichtigung aller relevanten Informationen könnte der Anstieg der HDGF-Spiegel als Bypass-Überlebenssignal dienen, um eine Resistenz gegen Gefitinib auszulösen, und Arzneimittelresistenzen können durch die Stummschaltung von HDGF überwunden werden.

Zusammenfassend ergab die vorliegende Untersuchung, dass HDGF nicht nur den malignen Phänotyp der NSCLC-Zellen förderte, sondern auch zur Gefitinib-Resistenz beitrug. Als Bypass- und kompensatorischer Signalweg aktiviert HDGF die EGFR-Downstream-Signalwege PI3K/Akt und MEK/ERK, die mit der Gefitinib-Resistenz verbunden sind. Die gezielte Behandlung von HDGF könnte die Gefitinib-Empfindlichkeit durch ein empfindliches Gleichgewicht zwischen HDGF-Expression und EGFR-Reaktivierung sowie deren gemeinsamen nachgeschalteten Molekülen wiederherstellen. Daher kann HDGF als potenziell zugrunde liegender Mechanismus der Gefitinib-Resistenz angesehen werden und ist ein vielversprechendes Ziel sowohl gegen NSCLC als auch zur Steigerung der TKI-Wirksamkeit bei NSCLC.

Die menschlichen NSCLC-Zelllinien H1975, H157, H460, H292 und PC-9 wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA) erworben, während A549- und H1650-Zellen von der National Infrastructure of Cell Line Resource (Peking, China) bezogen wurden. Alle Zellen wurden in RPMI-1640 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten.

Gefitinib wurde von AstraZeneca (Cheshire, UK) bezogen. Antikörper gegen Akt (9272), ERK1/2 (9102) und p-ERK1/2 (T202/Y204) (9101) wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) erworben. HDGF und p-Akt (Ser473) wurden von Abcam (Cambridge, UK) erhalten. EGFR und p-EGFR wurden von ABclonal (Wuhan, China) gekauft. GAPDH, β-Actin, β-Tubulin und Ki-67 wurden von TDYbio (Peking, China) gekauft. Rekombinanter menschlicher HDGF (rhHDGF) wurde von ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Israel) erhalten.

Das rekombinante HDGF-Plasmid im lentiviralen Vektor pLenti6/TR (Invitrogen) und das Mutationsplasmid pcDNA3.1-EGFR T790M wurden durch molekulares Klonen erhalten. Die Single-Guide-RNA (sgRNA) für HDGF wurde in das lentiCRISPRv2-Plasmid ligiert. NSCLC-Zellen wurden mit Plasmid transfiziert und ausgewählt, um eine stabile Zelllinie für weitere Untersuchungen zu erzeugen. Die Sequenzen für HDGF sgRNA1, sgRNA2, Kontroll-sgRNA (sgRNA-Con) und andere Primer sind in den Tabellen S1 und S2 aufgeführt.

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert. qRT‒PCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (40). Die Primersequenzen von HDGF und GAPDH sind in Tabelle S2 dargestellt.

Der Einfluss des HDGF-Knockdowns oder der Überexpression sowie der Induktion von rhHDGF auf das NSLCL-Zellwachstum wurde durch Zählen der Zellzahlen bestimmt. Der MTT-Assay wurde verwendet, um die Hemmung des Zellwachstums nach der Behandlung mit Gefitinib zu beurteilen. Kurz gesagt, 1 × 104 Zellen in 96-Well-Platten wurden 72 Stunden lang mit Gefitinib (0,001 ~ 50 μM) behandelt. Die optische Dichte bei 570 nm wurde gemessen und die IC50-Werte wurden mit der Software GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA) berechnet.

Die Zellen wurden in 6-cm-Kulturschalen mit 200 Zellen pro Schale ausgesät. Nach 14-tägiger Inkubation wurden die Zellen in 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit Kristallviolett angefärbt, und die Kolonien (Durchmesser > 40 μm) wurden gezählt und verglichen.

Die Experimente wurden in einer Boyden-Kammer mit 24 Vertiefungen wie zuvor beschrieben durchgeführt (40). Zellen wurden in einer Dichte von 3 × 104 für Migrations- und Invasionstests ohne oder mit Matrigel verwendet. Es wurden Fotos von vier zufällig ausgewählten Feldern gemacht und die Zellzahlen unter einem Mikroskop gezählt.

Das Immunblotting wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [22]. Proteinbanden wurden mit einem erweiterten Chemilumineszenz-Kit sichtbar gemacht und ihre Intensitäten wurden mit der ImageJ-Software gemessen.

Alle Tiere wurden von Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. (China) bezogen und unter Verwendung der von Excel generierten Zufallszahl zufällig in Versuchsgruppen eingeteilt. NSCLC-Xenotransplantate wurden durch subkutane Inokulation von Zellen in 6–8 Wochen alte männliche BALB/c-Nacktmikrofone (SCXK-2016-006) etabliert. Als das Tumorvolumen etwa 50–100 mm3 erreichte, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip aufgeteilt und wie unten beschrieben behandelt. Am Ende des Tests wurden die Mäuse getötet und Plasma und Tumore zur weiteren Analyse gesammelt.

Mäuse wurden in drei Gruppen eingeteilt und mit H1975-Zellen (5 × 105) mit sgRNA-Kontrolle, sgRNA1 oder sgRNA2, implantiert. Andere Mäuse wurden mit PC-9-Zellen (8 × 105) geimpft, die HDGF oder seine Vektorkontrolle überexprimierten. Die Wirkung des HDGF-Knockdowns auf die Wirksamkeit von Gefitinib in H1975-Zellen wurde in vier Gruppen von Mäusen untersucht: sgRNA-Kontrollgruppe oder sgRNA2, behandelt mit Gefitinib (50 mg/kg) oder Vehikel. Die Auswirkung der HDGF-Überexpression auf die Wirksamkeit von Gefitinib in PC-9-Zellen wurde in vier Gruppen bewertet: Vektorkontrolle oder HDGF-Überexpression, behandelt mit Gefitinib (10 mg/kg) oder Vehikel. Die Daten zum Tumorvolumen wurden blind erhoben. Der Student, der das Tumorvolumen maß, hatte keine Ahnung von den Gruppeninformationen.

HDGF-Konzentrationen im Mausplasma wurden mit einem Kit von Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) bewertet. HDGF-Spiegel im Plasma von NSCLC-Patienten wurden mit einem ELISA-Kit von Anrc (Tianjin, China) bestimmt.

Das immunhistochemische Verfahren (IHC) wurde wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden mit Antikörpern gegen HDGF oder Ki-67 inkubiert. Ein Peroxidase-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper von Jackson (West Grove, PA) wurde in PBS verdünnt. Die spezifische Bindung wurde mit dem Peroxidasesubstrat Diaminobenzidin (DAB) von Pierce (Rockford, IL) sichtbar gemacht.

Die Daten werden als Mittelwerte ± SDs dargestellt. Für die In-vitro-Studien wurden die Experimente mindestens dreifach durchgeführt. Für die In-vivo-Studien wurden in jede Gruppe 5 Mäuse einbezogen. Die Daten, die außerhalb der Mittelwerte ± 3 × SDs lagen, wurden gemäß den vorab festgelegten Kriterien ausgeschlossen. Die IC50-Werte wurden durch Anpassen der Daten in GraphPad Prism 6.0 ermittelt. Der Mann-Whitney-U-Test wurde durchgeführt, um die Genexpression zwischen verschiedenen Gruppen zu vergleichen, und andere Vergleiche wurden mithilfe des Student-t-Tests durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Datenvarianzen wurden mithilfe von F-Tests verglichen. Der Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um die Daten zu vergleichen, wenn der p-Wert der F-Tests kleiner als 0,05 ist. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL) durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, Moecks J, Keil L, Mok T, et al. Klinische Ergebnisse bei Patienten mit nichtkleinzelligem Lungenkrebs mit EGFR-Mutationen: Gepoolte Analyse. J Cell Mol Med. 2010;14:51–69.