Universelle Umleitung von CAR-T-Zellen gegen solide Tumoren über Membran

Dec 21, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Wirksamkeit von T-Zelltherapien mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) bei soliden Tumoren wird durch Schwierigkeiten bei der Auswahl eines wirksamen Zielantigens aufgrund der heterogenen Expression von Tumorantigenen und der Zielantigenexpression in gesunden Geweben beeinträchtigt. Hier zeigen wir, dass T-Zellen mit einem für Fluoresceinisothiocyanat (FITC) spezifischen CAR durch die intratumorale Verabreichung eines FITC-konjugierten Lipid-Poly(ethylen)-glykol-Amphiphils, das sich in Zellmembranen einfügt, gegen solide Tumoren gerichtet werden können. Bei syngenen und menschlichen Tumor-Xenotransplantaten in Mäusen führte die „Amphiphile-Markierung“ von Tumorzellen zu einer Tumorregression über die Proliferation und Akkumulation von FITC-spezifischen CAR-T-Zellen in den Tumoren. Bei syngenen Tumoren induzierte die Therapie die Infiltration von Wirts-T-Zellen, löste ein endogenes tumorspezifisches T-Zell-Priming aus und führte zu einer Aktivität gegen distale unbehandelte Tumore und zu einem Schutz vor Tumor-Rechallenge. Membraneinsetzende Liganden für bestimmte CARs könnten die Entwicklung adoptiver Zelltherapien erleichtern, die unabhängig von der Antigenexpression und dem Ursprungsgewebe wirken.

Die T-Zelltherapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) hat bei der Behandlung mehrerer hämatologischer Malignome1,2,3, darunter zuletzt des multiplen Myeloms4, klinische Erfolge erzielt; Dennoch war die Übertragung auf solide Tumoren eine Herausforderung5,6,7. Eine der größten Herausforderungen bei soliden Tumoren ist die Auswahl des Zielantigens. Aktuelle CARs zielen auf überexprimierte Selbstantigene oder mutierte Zelloberflächenproteine ​​ab, die von Krebszellen exprimiert werden. Allerdings ist die Antigenauswahl zur Bekämpfung solider Tumoren oft problematisch. Einerseits werden tumorassoziierte Antigene wie der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) oder Mesothelin häufig auch in gesunden Geweben exprimiert, was zu Toxizitäten am Zielort außerhalb des Tumors führt8,9,10. Andererseits ist die Expression mutierter Zelloberflächenproteine ​​wie des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors III (EGFRvIII) auf Krebszellen beschränkt, solche Neoantigene werden jedoch häufig heterogen exprimiert, was die Wahrscheinlichkeit einer Resistenz und/oder eines Antigenwachstums erhöht. negative Krebszellen11. Daher besteht ein großer Bedarf, optimalere Tumorantigene zu identifizieren oder alternative Strategien zu entwickeln, um CAR-T-Zellen gegen solide Tumoren zu richten. Beispiele für jüngste Fortschritte sind die Optimierung von CAR-Designs zur Verbesserung der Erkennung von Antigen-armen Tumorzellen12,13, multispezifische CARs, die mehr als ein Antigen erkennen13,14,15 und genetische Schaltkreise, die eine Antigen-Erkennungslogik ermöglichen (wie synNotch). Schaltkreise, um die CAR-Expression auf den Tumor zu beschränken16,17,18,19). Allerdings werden diese kombinatorischen Ansätze mit jedem zusätzlichen Antigen von Natur aus komplexer, und es bleibt ein komplexes Übersetzungsproblem, zu verstehen, wie solche genetischen Schaltkreise von CAR-T-Zellen so abgestimmt werden sollten, dass sie angesichts unterschiedlicher Antigenspiegel bei Patienten sicher und wirksam sind.

Ein immunologischer Mechanismus, mit dem die CAR-T-Zelltherapie die Tumorantigen-Heterogenität und den Antigenverlust bekämpfen kann, beruht auf dem Phänomen der Antigenausbreitung (oder Epitopausbreitung), wobei die Abtötung von Krebszellen durch CAR-T-Zellen die Freisetzung von Tumorantigenen in einer günstigen proinflammatorischen Richtung fördert Mikroumgebung, was zum Priming von de novo endogenen T-Zell-Antworten führt, die auf zusätzliche Antigene im Tumor abzielen20. Hinweise auf eine Epitopausbreitung wurden in präklinischen Studien an Mäusen beobachtet, darunter EGFRvIII-CAR-T-Zellen in murinen Gliomen21,22, Interleukin-13-Rezeptor-Untereinheit-Alpha-2 (IL-13Ra2)-CAR-T-Zellen in murinen Glioblastoma multiforme23 und CD19-CAR-T-Zellen, die auf induzierte solide Tumoren abzielen um CD19 auszudrücken (Lit. 24). Um die Antigenausbreitung zu verbessern, wurden T-Zellrezeptor-transgene und CAR-T-Zellen so konstruiert, dass sie den FMS-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden (Flt3L) sezernieren, um kreuzpräsentierende dendritische Zellen (DCs) zu vergrößern, die für diesen Prozess von entscheidender Bedeutung sind25.

Ein weiterer Ansatz zur Lösung des Problems der Antigenselektion bei soliden Tumoren bestand darin, exogene Antigene therapeutisch auf Tumorzellen zu induzieren, um das Targeting von CAR-T-Zellen zu ermöglichen. Beispielsweise wurden virale Gentherapie-Vektoren oder onkolytische Viren verwendet, um Tumorzellen mit beliebigen fremden Antigenen oder Antigenen mit einem bekannten Nebenwirkungsprofil in der CAR-T-Zelltherapie (wie CD19) zu transduzieren (Ref. 24,26,27). . Dies ist ein attraktiver Ansatz, da Antigene ausgewählt werden können, ohne dass ein Cross-Targeting mit gesundem Gewebe befürchtet werden muss, und die Induktion der Antigenausbreitung durch den Angriff von CAR-T-Zellen auf transduzierte Tumoren endogene T-Zell-Antworten fördert, die das Entkommen von Antigenverlusten begrenzen und systemischen Antitumor bereitstellen Immunität24,27. Eine translatorische Einschränkung bei der Einführung fremder Antigene über manipulierte Viren ist jedoch die Heterogenität und hochvariable Transduktion, die virale Vektoren sowohl innerhalb einzelner Tumoren als auch zwischen Tumoren von Patient zu Patient erreichen28,29,30.

Wir haben das Verhalten amphiphiler Moleküle umfassend untersucht, die aus therapeutischen Verbindungen bestehen, die an amphiphile Poly(ethylenglykol)(PEG)-Lipide konjugiert sind. Diese „Amph-Ligand“-Konjugate weisen mehrere nützliche Eigenschaften zur Steuerung der Pharmakokinetik und Bioverteilung verknüpfter therapeutischer Nutzlasten wie Peptide, Proteine ​​oder kleine Moleküle auf31,32,33. Beispielsweise können Amph-Liganden ihre Lipidschwänze in vitro und in vivo ohne Toxizität in die Plasmamembran von Zellen einführen, was zur Darstellung der gebundenen Verbindungen auf der Zelloberfläche führt21,31. Nach der parenteralen Injektion gelangen Amph-Liganden auch effizient in entwässernde Lymphknoten (LNs) und dekorieren die Oberflächen von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)21. Wir nutzten diese physikalische Chemie zuvor, um LN-APCs mit Liganden für CAR-T-Zellen zu dekorieren und so einen Impfeffekt bei der Drainage von LNs zu erzeugen, der die Proliferation, Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen steigerte21.

In diesem Artikel berichten wir über eine Strategie zur Verwendung von Amph-Liganden als Mittel, um CAR-T-Zellen gegen jeden soliden Tumor umzulenken. Wir zeigen, dass ein amphiphiles Konjugat des kleinen Moleküls Fluoresceinisothiocyanat (FITC), das Krebszellen in vitro zugesetzt wird, zu einer Plasmamembrandekoration der Tumorzellen führt, was die Erkennung durch CAR-T-Zellen ermöglicht, die FITC-spezifische chimäre Rezeptoren tragen, und die Aktivierung von CAR-T-Zellen auslöst. Proliferation und Abtötung der mit Amph-FITC dekorierten Zielzellen. In vivo führt die intratumorale (it) Injektion von amph-FITC, gefolgt von einer systemischen Infusion von FITC-spezifischen CAR-T-Zellen, zur Aktivierung und Akkumulation von CAR-T-Zellen in Tumoren, begleitet von einer Tumorregression in Modellen von soliden Xenotransplantat-Tumoren bei Mäusen und Menschen. Die durch Amph-FITC stimulierte CAR-T-Zellaktivität löste auch die Auslösung einer endogenen tumorspezifischen T-Zell-Antwort aus, die „abskopale“ Reaktionen gegen distale unbehandelte Tumore und ein Immungedächtnis gegen Tumor-Rechallenge induzierte. Daher können Amph-FITC-gerichtete CAR-T-Zellen einen Ansatz für eine sichere und wirksame Tumorregression und für eine systemische Antitumorimmunität darstellen, der auf jeden soliden Tumor angewendet werden kann, unabhängig vom Ursprungsgewebe oder dem bösartigen Genotyp.

Wir stellten uns vor, dass die membraneinführenden Eigenschaften von PEG-Lipid-Konjugaten genutzt werden könnten, um Tumorzellen mit Liganden für ein CAR zu dekorieren und so den Tumor so zu „bemalen“, dass er von CAR-T-Zellen erkannt wird. In diesem Fall ist die Wahl des CAR-T-Zellliganden willkürlich und wir haben uns für die Verwendung von FITC als sichere, nicht immunogene Verbindung entschieden, um CAR-T-Zellen gegen Tumore auszurichten. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verabreichung von 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-PEG-FITC (DSPE-PEG-FITC oder Amph-FITC) die Erkennung und Abtötung von Tumorzellen durch FITC-spezifische CAR-T-Zellen ermöglichen würde (Abb. 1a).

a, Schematische Darstellung der Amph-FITC-Struktur, der Einfügung in Krebszellmembranen und der Erkennung durch FITC-CAR-T-Zellen. Erstellt mit Biorender.com. b,c, B16F10-Mäuse-Melanomzellen wurden mit Amph-FITC in den angegebenen Konzentrationen 30 Minuten lang bei 37 °C in PBS inkubiert, mit einem Anti-FITC-Antikörper angefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dargestellt sind repräsentative Histogramme der gesamten FITC- (b) und Anti-FITC-Signale (c). d, B16F10-Zellen wurden mit Amph-FITC-Konjugaten unterschiedlichen PEG-MW wie in b bei den angegebenen Konzentrationen inkubiert und dann mit Anti-FITC für die Durchflusszytometrieanalyse angefärbt. Dargestellt sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) der FITC- (links) und Anti-FITC-Signale (rechts). e, Kinetische Analyse des Anti-FITC-MFI von B16F10, kultiviert in RPMI, nach Markierung in 100 nM Amph-FITC. f, Histogramme von MC38-Dickdarmkrebszellen, die mit titrierten Konzentrationen von Amph-FITC markiert wurden, um die gleiche FITC-Fluoreszenz pro Zelle zu erzielen (oben). Anschließend wurden Krebszellen mit 4m5.3-28z CAR-T-Zellen in einem E:T-Verhältnis von 1:1 kultiviert. g, h, Co-Kultur von FITC-spezifischen E2-m28z-CAR-T-Zellen oder nicht transduzierten Kontroll-T-Zellen mit B16F10- (g) oder CT-2A- (h) Krebszellen mit oder ohne Beschichtung durch 100 nM Amph-FITC in einem Bereich von E:T-Verhältnisse. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus doppelten Proben (alle biologischen Replikate). Die P-Werte wurden durch Zwei-Wege-ANOVA bestimmt. NS, nicht signifikant; ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Quelldaten

Wir untersuchten zunächst die Markierung von Krebszellen in vitro durch Inkubation von Amph-FITC mit murinen B16F10-Melanomzellen für 30 Minuten bei 37 °C. Die durchflusszytometrische Analyse der Melanomzellen ergab eine dosisabhängige Assoziation von Amph-FITC mit den Zellen (Abb. 1b), und FITC wurde auf den Zelloberflächen freigelegt, wie durch anschließende Färbung von Amph-FITC-beschichteten Zellen mit einem Anti-FITC gezeigt wurde Antikörper (Abb. 1c). In ähnlicher Weise könnte Amph-FITC auch mit den Oberflächen von murinen MC38-Kolonkarzinomzellen und murinen CT-2A-Glioblastomzellen assoziieren und auf diesen exponiert werden (ergänzende Abbildung 1a, b). Es ist bekannt, dass die physische Position von CAR-Epitopen auf Zielantigenen (näher oder weiter von der Zellmembran entfernt) die Signalübertragung des chimären Rezeptors und die CAR-T-Aktivierung beeinflusst34,35. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass die Länge der Polymerkette auf PEG-DSPE-Amphiphilen die Membraninsertion beeinflusst32. Um zu bestimmen, wie sich die PEG-Linkerlänge von Amph-FITC auf die Membraninsertion und die Stabilität der Markierung auswirkt, inkubierten wir B16F10-Zellen mit Amph-FITC-Molekülen, die aus einem Bereich von PEG-Molekulargewichten (MW) zusammengesetzt waren, und maßen die resultierende gesamte zellassoziierte Zelloberfläche - FITC in verschiedenen Konzentrationen exponiert (Abb. 1d), dann die Zellen in frisches Medium gewaschen und den Verlust des FITC-Signals über 48 Stunden verfolgt (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1c). DSPE-PEG2k-FITC erreichte die höchste Insertion bei niedrigen Konzentrationen und zeigte die größte Persistenz, wobei nach 24 Stunden in frischem Medium noch eine erhebliche Markierung nachweisbar war.

Als nächstes testeten wir die CAR-T-Zellerkennung von B16-Zellen, die mit Amph-FITC-Molekülen dekoriert waren. FITC-spezifische CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion primärer muriner CD8+-T-Zellen mit einem CAR erzeugt, der aus den FITC-spezifischen einkettigen variablen Fragmenten (scFvs) 4m5.3 (Ref. 36) oder E2 (Ref. 37) fusioniert mit a besteht CD8-Gelenk, CD8-Transmembrandomäne, CD28-kostimulatorische Domäne und CD3ζ-Signaldomäne ähnlich unseren zuvor berichteten Designs 21 (im Folgenden als 4m5.3-28z- und E2-28z-CARs abgekürzt, ergänzende Abbildung 2a – d). Um zu beurteilen, wie die Länge des PEG-Linkers die Fähigkeit FITC-spezifischer CAR-T-Zellen beeinflusst, mit Amph-FITC dekorierte Zielzellen zu erkennen, inkubierten wir MC38-Dickdarmkrebszellen mit Amph-FITC unterschiedlichen Molekulargewichts in Konzentrationen, die so titriert wurden, dass sie die gleiche mittlere Anzahl an FITC ergaben Moleküle pro Zelle (Abb. 1f, oben) und fügte dann 4m5,3-28z CAR-T-Zellen zu den markierten Tumorzellen in einem Bereich von Effektor:Ziel (E:T)-Verhältnissen hinzu. DSPE-PEG2k-FITC und DSPE-PEG3.4k-FITC lösten eine starke CAR-T-Zellaktivierung aus, wie durch die Sekretion von Interferon-Gamma (IFN-γ) festgestellt wurde, während DSPE-PEG1k-FITC mit niedrigerem Molekulargewicht viel weniger wirksam war (Abb. 1f, unten). Aufgrund seiner optimalen Zellmembraninsertion und CAR-T-Stimulationseigenschaften konzentrierten wir uns daher für weitere Studien auf DSPE-PEG2k-FITC. Die DSPE-PEG2k-FITC-Markierung löste die Aktivierung von E2-28z-CAR-T-Zellen aus, begleitet von der Zytokinsekretion und der effizienten Abtötung von B16F10-Zellen und CT-2A-Gliomzellen der Maus durch FITC-CAR-T-Zellen (Abb. 1g, h). Somit können mit diesem optimalen Amph-FITC-Molekül verschiedene Krebszellen für eine effektive Aktivierung von CAR-T-Zellen und die Abtötung von Zielzellen markiert werden.

Als nächstes untersuchten wir die Tumormarkierung in vivo nach der Injektion von Amph-FITC, wobei wir eine Dosis Amph-FITC (10 nmol) verwendeten, von der wir zuvor festgestellt hatten, dass sie für die Impfsteigerung von CAR-T-Zellen wirksam ist21. Nach einer einzigen Injektion in etablierte B16F10-Tumoren markierte Amph-FITC große Bereiche des Tumors, wie histologisch nachgewiesen wurde (Abb. 2a). Um das mögliche Austreten von Amph-FITC außerhalb des Tumors in umgebendes gesundes Gewebe zu beurteilen, analysierten wir Tumorabschnitte und angrenzendes Nicht-Tumorgewebe mittels Immunhistochemie. Während die Injektionen in einigen Fällen dazu führten, dass sich Amph-FITC in der Nähe der Tumorränder ansammelte, beobachteten wir eine sehr geringe Aufnahme von Amph-FITC auf Zellen im benachbarten Gewebe (Abb. 2b). Die Quantifizierung von FITC, das 24 Stunden nach der Injektion aus dem Tumor, den tumordrainierenden Lymphknoten (TDLNs) und anderen distalen Geweben extrahiert wurde, ergab, dass Amph-FITC weitgehend auf den Tumor und die Drainage inguinaler und axillärer LNs beschränkt blieb (Abb. 2c). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Aufnahme von Amph-FITC in die drainierenden LNs die Proliferation und Funktion von CAR-T-Zellen durch die Dekoration von LN-residenten APCs unterstützen könnte, wie in unseren früheren Studien beschrieben, in denen Amph-FITC als Impfstoff für CAR-T-Zellen eingesetzt wurde21.

C57BL/6-Mäusen wurden 106 B16F10-Tumoren in der Flanke inokuliert, gefolgt von einer Injektion von 10 nmol DSPE-PEG2k-FITC, als die Tumoren eine Größe von 25 mm2 erreichten. a: Konfokale Mikroskopie von B16F10-Tumoren 24 Stunden nach der Amph-FITC-Injektion. Dargestellt ist ein repräsentatives histologisches Bild von zwei analysierten Tumoren. b: Insgesamt 106 B16F10-Zellen wurden in C57BL/6-Mäuse geimpft (n = 4 pro Gruppe) und intratumoral mit 10 nmol Amph-FITC injiziert, wenn die Tumoren eine Größe von ~25 mm2 hatten. Zwei Stunden später wurden die Tumoren mit benachbartem Bindegewebe isoliert, kryogeschnitten und mit Anti-Trp1-Antikörper zur Identifizierung von Melanomzellen, Anti-FITC und einer Zellmembranfärbung angefärbt. Dargestellt sind repräsentative Abschnitte aus einer PBS-Kontrolle und zwei mit Amph-FITC injizierten Tumoren. Maßstabsbalken, 200 μm. c, Bioverteilung von amph-FITC 24 Stunden nach der Injektion in B16F10-Tumoren (n = 5 Tiere pro Gruppe). d, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme von mit Amph-FITC injizierten B16-Tumoren (gesteuert auf CD45−-Zellen), gefärbt mit Anti-FITC, um oberflächenexponiertes Antigen zu erkennen. e, Immunphänotypisierung von B16F10-Tumoren in Mäusen ohne vorherige LD 1, 24 und 48 Stunden nach der Amph-FITC-Injektion, Quantifizierung des Anteils von FITC+-Anti-FITC+-doppelt-positiven Zellen (links) und der Dichte von FITC+-Anti-FITC+-Zellen im Tumor (rechts) (n = 5 Tiere pro Gruppe). Alle Replikate sind biologische Replikate. Die P-Werte wurden durch den Mann-Whitney-U-Test (d) oder den ungepaarten Student-t-Test (e) bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SD NS, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Quelldaten

Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte, dass FITC 24 Stunden nach der Injektion von einem großen Teil der Tumorzellen aufgenommen wurde und an Zelloberflächen zugänglich blieb, wie durch Anfärben mit einem Anti-FITC-Antikörper nachgewiesen wurde (Abb. 2d). Wie erwartet waren unter den vielen Zelltypen innerhalb des Tumors sowohl Krebszellen als auch Wirtszellen (d. h. infiltrierende myeloische Zellen und T-Zellen) mit FITC markiert (Abb. 2e und ergänzende Abb. 3a), mit ~ 40–60 % von jedem Zelltyp, der nach 1 Stunde extrazellulär exponiertes FITC trägt, und 20–40% der Zellen, die nach 24 Stunden noch exponiertes FITC tragen (Abb. 2e, links und ergänzende Abb. 4). Aufgrund ihrer relativen Häufigkeit waren jedoch zahlenmäßig nach 24 Stunden die überwiegende Mehrheit der mit FITC oberflächendekorierten Zellen Krebszellen (Abb. 2e, rechts). Da Lymphodepletion (LD), die üblicherweise zur Förderung der Transplantation von CAR-T-Zellen eingesetzt wird, die Amph-FITC-Aufnahme beeinflussen könnte, führten wir auch eine Analyse der FITC-Zellverteilung bei Tieren durch, die 24 Stunden vor der Amph-FITC-Injektion LD durch 5 Gy Ganzkörperbestrahlung (TBI) erhielten . Durch die LD-Vorbehandlung wurden die Immunzellen erheblich dezimiert und die Markierung von Krebszellen in noch größerem Maße begünstigt (ergänzende Abbildungen 3b, c und 4). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Verabreichung die Verfügbarkeit von Amph-FITC für den Tumor und die TDLNs wirksam einschränkt, was zu einer robusten FITC-Markierung auf der Oberfläche von Krebszellen führt.

Als nächstes charakterisierten wir die Fähigkeit FITC-spezifischer CAR-T-Zellen, Tumore zu erkennen, denen Amph-FITC injiziert wurde, und verfolgten die CAR-T-Zellexpansion und Tumor-Homing mittels Biolumineszenz-Bildgebung. Mäuse mit B16F10-Tumoren wurden durch TBI lymphodepletiert, gefolgt von einem adoptiven Transfer von Firefly-Luciferase-exprimierenden E2-28z-CAR-T-Zellen. Beginnend zwei Tage später wurde amph-FITC intratumoral und danach alle drei Tage verabreicht, um alle Tumorzellen erneut zu markieren, die noch nicht durch CAR-T-Zellen abgetötet worden waren (Abb. 3a, CAR T + IT-FITC). Wir entschieden uns dafür, die erste Dosis amph-FITC nach der CAR-T-Verabreichung zu verabreichen, um die Zeit zu maximieren, in der CAR-T-Zellen auf Tumorzellen treffen, die mit einem hohen Anteil des FITC-Liganden ausgestattet sind. Um den Angriff von CAR-T-Zellen auf FITC-markierte Tumore weiter zu unterstützen, haben wir in einer separaten Gruppe auch die Wirkung des CAR-T-Zelltransfers (± it amph-FITC) in Kombination mit einer einmal wöchentlichen bilateralen subkutanen Injektion von amph-FITC zusammen mit dem getestet Stimulator der Interferon-Gene (STING) Agonist zyklisches Di-GMP-Adjuvans als Impfstoffschub. Diese Injektion richtet Amph-FITC auf DCs in entwässernden LNs und wirkt als Impfstoff für die CAR-T-Zellen, wodurch die Expansion der CAR-T-Zellen und eine erhöhte Funktionalität ausgelöst werden, wie wir bereits berichtet haben21. Die Biolumineszenzbildgebung von CAR-T-Zellen, die ohne Amph-FITC-Behandlung in Mäuse übertragen wurden, ergab einen geringen Grad an E2-28z-CAR-T-Zellexpansion über 14 Tage ohne wesentliche Infiltration von Tumoren (Abb. 3b, c). Die Verabreichung von Amph-FITC oder Amph-FITC-Impfung löste einzeln eine CAR-T-Zellexpansion aus, aber die Amph-FITC-Impfung allein löste eine stärkere Akkumulation von CAR-T-Zellen in der Nähe der Impfstoffinjektionsstelle nahe der Schwanzbasis und nicht im Tumor aus. Im Gegensatz dazu führte Amph-FITC zu einer vergleichbaren Gesamtexpansion der CAR-T-Zellen in den ersten 7 Tagen, jedoch zu einer stärkeren Akkumulation an der Tumorstelle (Abb. 3b, c). Die Zugabe des Impfstoffboosts zur Amph-FITC-Behandlung hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die gesamte T-Zell-Expansion oder -Akkumulation an der Tumorstelle. Wir wiederholten dieses Experiment zur Behandlung von CT-2A-Tumoren und die Analyse der behandelten Tumoren am Tag 12 ergab eine erhebliche T-Zell-Infiltration im gesamten Tumor (höchstwahrscheinlich durch CAR-T-Zellen aufgrund der zeitlichen Nähe zu LD) (Abb. 3d, e). Wir analysierten auch die E2-28z-CAR-T-Zell-Infiltration von MC38-Kolonkarzinomen und stellten nach der Amph-FITC-Behandlung einen Anstieg der Häufigkeit von CAR-T-Zellen sowohl im peripheren Blut als auch im Tumor fest (Extended Data Abb. 1a–c). Somit führt die Amph-FITC-Behandlung sowohl mit als auch ohne unterstützende Amph-FITC-Impfung zu einer signifikanten Vergrößerung der CAR-T-Zellpopulation und der Infiltration von Tumoren durch E2-28z-CAR-T-Zellen.

a, Schema und Zeitplan der Therapie bei B16F10-Tumoren, einschließlich CAR-T-Boosterimpfstoff. Erstellt mit Biorender.com. b,c, Lokalisierung von FLuc+ E2-m28z FITC CAR T-Zellen in B16F10-tumortragenden Mäusen am Tag 8 (b) und Quantifizierung der gesamten Maus- (oben) und Tumorstrahlung (unten) (c) (n = 5 Tiere pro Gruppe). , biologische Replikate). Der weiße gestrichelte Kreis zeigt die Lage des Flankentumors an. d, Repräsentative Immunhistochemie an CT-2A-Tumoren, die mit dem Amph-FITC ± Amph-FITC-Impfstoff behandelt wurden, Färbung auf CD8, am Tag 12 nach dem adoptiven Transfer. Maßstabsbalken, 50 µm. e, Quantifizierung von CD8+ T-Zellen pro mm2 pro Sichtfeld (FOV) in 10 FOV pro Tumor, n = 10 FOV pro Zustand. Replikate sind technische Replikate zur Erfassung der T-Zell-Infiltration über viele FOVs innerhalb des Tumors. Die P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA mit Tukeys Post-Hoc-Test bestimmt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (c) und des Standardfehlers (e) dar. NS, nicht signifikant; ****P < 0,0001.

Quelldaten

Anschließend bewerteten wir die therapeutische Wirkung des FITC-zielenden CAR-T-Zelltransfers in Kombination mit der Amph-FITC- und Amph-FITC-Impfung in den B16F10- und CT-2A-Tumormodellen gemäß den experimentellen Zeitplänen in Abb. 3a bzw. Abb. 4a . Wir testeten zunächst die Behandlung des hochaggressiven, schwach immunogenen B16F10-Modells und bewerteten die Behandlung mit oder ohne Einbeziehung einer Amph-FITC-Impfstoffauffrischung. Wie in Abb. 4b gezeigt, stoppten die durch Amph-FITC umgeleiteten E2-28z-CAR-T-Zellen das Fortschreiten des Tumors für etwa zwei Wochen und verlängerten das Überleben. Die Zugabe einer Auffrischung des Amph-FITC-Impfstoffs zeigte einen Trend zu einer etwas besseren Tumorregression und Verlängerung der Überlebenszeit, wodurch sich die mittlere Überlebenszeit um 3 Tage erhöhte. Um festzustellen, ob die LD-Methode das Ansprechen auf diese Therapie beeinflusst, haben wir vor dem CAR-T-Zelltransfer auch die Behandlung mit dem klinischen Chemotherapie-LD-Regime aus Cyclophosphamid und Fludarabin getestet und eine ähnliche Antitumoraktivität beobachtet (Extended Data, Abb. 2a).

a, Schema und Zeitplan der Therapie für die CT-2A-Tumortherapie. b, Tumorwachstum und Gesamtüberleben von C57BL/6-Mäusen (n = 5 Tiere pro Gruppe), die B16F10-Tumoren tragen, behandelt mit E2-28z-CAR-T-Zellen wie in Abb. 3a mit den angegebenen Kombinationen. c, Tumorwachstum von CT-2A-tumortragenden C57BL/6-Mäusen (n = 5 Tiere pro Gruppe), behandelt mit Amph-FITC, FITC-CAR-T-Zellen und einem Impfstoff, der nur aus CD8+-T-Zellen oder einer Kombination aus CD4+- und CD8+-T-Zellen besteht . d, Tumorwachstum und Überleben nach Behandlung von CT-2A-tumortragenden Mäusen (n = 5 Tiere pro Gruppe) mit CARs mit niedriger (E2.7), mittlerer (E2) und hoher (4m5.3) Affinität für FITC, einschließlich es Amph-FITC und Impfstoff. e,f, Tumorwachstum (e) und Überleben (f) von CT-2A-tumortragenden Mäusen, die mit CARs behandelt wurden, die kostimulatorische CD28- oder 4-1BB-Domänen über einen Bereich von Bindungsaffinitäten hinweg in Kombination mit IT-Amph-FITC und Amph tragen -FITC-Impfung (n = 5 Tiere pro Gruppe). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Alle Replikate sind biologische Replikate. Die P-Werte wurden durch Zwei-Wege-ANOVA (Tumorwachstumskurven) und Log-Rank-Test (Mantel-Cox) (Überlebenskurven) bestimmt. NS, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Quelldaten

Als nächstes wandten wir uns dem CT-2A-Tumormodell zu, da es sich um einen langsam fortschreitenden Tumor handelt, der für eine Immuntherapie besser geeignet ist, und versuchten, Faktoren zu analysieren, die die therapeutische Wirksamkeit der FITC CAR T-Behandlung bestimmen. Zuerst haben wir die Wirkung der CD4/CD8-Zusammensetzung im CAR-T-Zellprodukt getestet. Der adoptive Transfer von ausschließlich CD8+ E2-28z CAR T-Zellen in Kombination mit Amph-FITC und Impfung stoppte das Fortschreiten von CT-2A-Tumoren für drei Wochen (Abb. 4c). Obwohl LD allein das Fortschreiten des Tumors verzögerte (Extended Data Abb. 2b), war dieser Effekt viel schwächer als die Reaktion, die durch die Kombination von adoptivem Transfer mit Amph-FITC hervorgerufen wurde. Interessanterweise war der Transfer einer äquivalenten Anzahl muriner CAR-T-Zellen, die mit einem CD8+:CD4+-Verhältnis von ~1:1 hergestellt wurden, im Gegensatz zu Beweisen, die eine wichtige Rolle von CD4+-CAR-T-Zellen in humanisierten Mausmodellen von Mesotheliom oder Lymphom38,39 belegen, wesentlich geringer wirksam (Abb. 4c).

Angesichts der Fülle an Literatur, die auf wichtige Auswirkungen der CAR-Affinität und der kostimulierenden Domänenauswahl auf das Ergebnis der traditionellen CAR-T-Therapie 40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 hinweist, haben wir als Nächstes die Auswirkungen bewertet Diese CAR-Designparameter beeinflussen die Wirksamkeit der Amph-FITC-umgeleiteten CAR-T-Behandlung. Um die CAR-Affinität zu modulieren, verglichen wir die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die das E2-FITC-spezifische scFv (KD = 2,4 nM) trugen, mit CARs, die aus einem FITC-scFv mit sehr hoher Affinität, 4m5,3 (KD = 300 fM), hergestellt wurden das scFv E2.7 mit geringerer Affinität (KD = 8,9 nM), das sich vom Wildtyp (WT) E2 durch eine einzelne Aminosäuresubstitution unterscheidet. Jede dieser drei scFv-Varianten-CARs wurde entweder mit einer co-stimulierenden Domäne von CD28 oder einem Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-Liganden-Superfamilie 9 (TNFSF9, im Folgenden als 4-1BB bezeichnet) hergestellt, um die Rolle der co-stimulierenden Signalübertragung weiter zu untersuchen. Wie in der ergänzenden Abbildung 5 gezeigt, zeigten murinen CD8+-T-Zellen eine effiziente Transduktion und Expression jedes dieser CARs, obwohl die CD28-basierten CARs etwa 10-fach höhere Werte exprimierten als die 4-1BB-CARs. Zusammen mit der Amph-FITC + FITC-Impfung zeigten alle diese FITC-spezifischen CAR-T-Zellen ähnliche therapeutische Wirksamkeiten bei der Behandlung von C2TA-Tumoren und der Verlängerung des Überlebens der Tiere, mit Ausnahme der E2.7-BBz CAR, die etwas geringer war wirksam (Abb. 4d–f). CARs mit kostimulatorischen CD28-Domänen zeigten jedoch eine frühere Kontrolle des Tumorwachstums im Vergleich zu CARs mit kostimulatorischen 4-1BB-Domänen, unabhängig von der Affinität des scFv (Abb. 4e). Das wirksamste E2-28z CAR löste bei 40 % der Tiere vollständige Reaktionen aus. Aufgrund seiner therapeutischen Wirksamkeit und überlegenen Expression haben wir uns entschieden, uns für nachfolgende Studien auf dieses CAR zu konzentrieren.

Schließlich führten wir Experimente durch, die darauf abzielten, die Dosierung von Amph-FITC und die Vorbereitung maximal wirksamer CAR-T-Zellen in diesem Behandlungsparadigma zu optimieren. Wir haben zunächst die Bedeutung der Dosierungshäufigkeit beurteilt, da eine Dosierung alle paar Tage über mehrere Wochen möglicherweise nur bei oberflächlichen Läsionen bei Krankheiten wie Melanomen oder Kopf- und Halskrebs klinisch machbar ist. Interessanterweise verringerte die Reduzierung der Injektionshäufigkeit auf einmal alle 6 Tage die therapeutische Wirkung nicht (Extended Data Abb. 3a). Schließlich ist auch bekannt, dass die Ex-vivo-Kultur von CAR-T-Zellen in IL-7 und IL-15 anstelle von herkömmlichem IL-2 den Phänotyp des zentralen Gedächtnisses (TCM) begünstigt und die Tumorkontrolle erhöht50,51,52. Allerdings zeigten FITC-CAR-T-Zellen, die in IL-7 und IL-15 statt in IL-2 expandierten, keine verbesserte Tumorkontrolle (Erweiterte Daten, Abb. 3b). Daher haben wir unsere Therapie abgeschlossen, um in IL-2 expandierte E2-28z-CAR-T-Zellen für weitere Studien zu verwenden.

Ein Hauptproblem bei der chemischen Abgabe eines CAR-T-Liganden ist das Potenzial der Verbreitung von Amph-FITC, um einen Angriff von CAR-T-Zellen auf gesundes Gewebe auszulösen. Wir fanden heraus, dass die lokale Verabreichung von Amph-FITC normales Gewebe nur minimal markiert (Abb. 2b), und wir konnten während der Behandlung keine offensichtliche Entzündung der Haut um die behandelten Tumoren feststellen, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der CAR-T-Zellen in erster Linie erhalten bleibt Die Tatsache, dass E2-28z-CAR-T-Zellen nach der Amph-FITC-Behandlung im peripheren Blut expandierten (Extended Data Abb. 1b), veranlasste uns, mögliche systemische Toxizitäten zu bewerten. In Therapiestudien zeigten Mäuse, die CAR-T-Zellen zusammen mit der Amph-FITC- und FITC-Impfung erhielten, keinen Gewichtsverlust und nahmen im Laufe der Zeit an Masse zu, was von unbehandelten Kontrolltieren nicht zu unterscheiden war (Erweiterte Daten, Abb. 4a, b). Wir haben die Serumzytokine 24 Stunden nach der Amph-FITC-Injektion am Tag 3 und Tag 12 nach dem E2-28z-CAR-T-Zelltransfer im CT-2A-Tumormodell gemessen und konnten mit Ausnahme eines niedrigen IFN-Spiegels keinen Anstieg der entzündlichen Zytokine feststellen -γ am Tag 3 (Extended Data Abb. 4c). Wir konnten auch keine Erhöhung der Leberenzyme Alanintransaminase (ALT) oder Aspartattransaminase (AST) zu entsprechenden Zeitpunkten feststellen, was auf einen Mangel an Lebertoxizität hinweist (Extended Data Abb. 4d). Somit scheint die Therapie mit amph-FITC und FITC-spezifischen CAR-T-Zellen sicher und gut verträglich zu sein.

Wir stellten die Hypothese auf, dass durch die Umleitung von CAR-T-Zellen gegen injizierte Läsionen Tumorantigene in einer günstigen entzündungsfördernden Mikroumgebung freigesetzt werden könnten, die das endogene T-Zell-Priming und die Induktion einer systemischen Antitumor-Immunantwort vorantreiben würde. Obwohl wir TBI zu Beginn der Behandlung eingesetzt haben, um die Transplantation von CAR-T-Zellen zu fördern, ist bekannt, dass sich Lymphozyten nach LD53 schnell erholen, und andere Studien haben Hinweise auf endogene Immunantworten gemeldet, die durch die CAR-T-Zelltherapie ausgelöst wurden, trotz der Verwendung von Lymphodepletionstherapien21,25 . Wir untersuchten zunächst die Infiltration von CD45.2+ CD4+ und CD8+ T-Zellen des Wirts in CT-2A-Tumoren, die mit Amph-FITC und CD45.1+ CAR T-Zellen behandelt wurden. Während unbehandelte Tumoren sehr geringe Mengen an tumorinfiltrierenden Lymphozyten aufwiesen, löste die Behandlung mit Amph-FITC/CAR T eine starke Infiltration durch CD45.2+-Wirts-T-Zellen aus (Abb. 5a). Um die mögliche Induktion des endogenen T-Zell-Gedächtnisses durch die Behandlung mit Amph-FITC/CAR T zu beurteilen, haben wir Mäuse, die CT-2A-Tumoren als Reaktion auf die Therapie mit Amph-FITC/E2-28z CAR T abgestoßen hatten, mit Tumorzellen auf der gegenüberliegenden Flanke erneut belastet. Während mit CT-2A-Zellen geimpfte Kontroll-naive Mäuse ein stetiges Fortschreiten des Tumors zeigten, lehnten alle durch die Amph-FITC/CAR-T-Behandlung geheilten Mäuse die erneute Belastung ab, obwohl im neuen Tumor kein FITC vorhanden war (Abb. 5b), was auf die Induktion hindeutet des schützenden endogenen T-Zellgedächtnisses.

a, Durchflusszytometrie an behandelten CT-2A-Tumoren am Tag 34 nach adoptivem Transfer von CD45.2+ FITC CAR T-Zellen, Quantifizierung von CD4+ versus CD8+ CD45.1+ tumorinfiltrierenden Wirts-T-Zellen (n = 4 Tiere pro Gruppe). b: CT-2A-tumortragende Mäuse, die zuvor mit CAR T- und Amph-FITC-Therapie geheilt worden waren, wurden im Vergleich zu naiven Mäusen mit 106 CT-2A-Krebszellen auf der gegenüberliegenden Flanke am Tag 92 nach dem adoptiven Transfer erneut belastet (n = 5 Tiere pro Gruppe). c,d, Repräsentative Flussdiagramme von DCs (c) in Tumoren und TDLN von Mäusen, die tdTomato+ CT-2A-Tumoren tragen, 12 Tage nach dem adoptiven Transfer und Quantifizierung (d) von tdTomato+ DCs in TDLN (n = 3 Tiere pro Gruppe für Nr CAR T-Gruppe, n = 4 für CAR T + it FITC-Gruppe). e,f, Expression der Aktivierungsmarker CD86 (e) und CCR7 (f) in TDLN-DCs 12 Tage nach dem adoptiven Transfer mit repräsentativen Histogrammen (n = 3 Tiere pro Gruppe für keine CAR T-Gruppe, n = 5 für CAR T + es FITC-Gruppe). g, ELISPOT auf der Milz von CT-2A-tumortragenden Mäusen am Tag 37 nach dem adoptiven Transfer (n = 5 Tiere pro Gruppe). Splenozyten wurden mit bestrahlten CT-2A-Krebszellen stimuliert. Alle Replikate sind biologische Replikate. Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-T-Test bestimmt. Fehlerbalken stellen SD NS dar, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01.

Quelldaten

Ein wichtiger Schritt zur Auslösung endogener T-Zell-Antworten ist der Erwerb von Tumorantigenen durch dendritische Zellen (DCs). Um festzustellen, ob die Amph-FITC/CAR-T-Therapie die DC-Aufnahme von Tumorzelltrümmern förderte, behandelten wir tdTomato+ CT-2A-Tumoren und stellten fest, dass Immunzellen, vor allem DCs sowohl im Tumor als auch im tumordrainierenden LN, zu tdTomato+ wurden, was auf eine Aufnahme von tdTomato+ hindeutet Tumorantigene (Abb. 5c,d). Darüber hinaus exprimierten mehr DCs im TDLN die Aktivierungsmarker CD86 und CCR7 (Abb. 5e, f). Daher fördert die Umleitung von CAR-T-Zellen gegen Tumore durch Amph-FITC-Dekoration die Antigenabgabe an und die Aktivierung professioneller APCs, die das endogene T-Zell-Priming steuern. Schließlich untersuchten wir direkt die Entwicklung tumorspezifischer endogener T-Zellen nach der Behandlung mit Amph-FITC/E2-28z-CAR-T-Zellen, indem wir Splenozyten von mit Amph-FITC/CAR T behandelten Mäusen ex vivo mit bestrahlten CT-2A-Tumorzellen restimulierten. Wie in Abb. 5g gezeigt, bestätigte die Restimulation von Splenozyten behandelter Tiere mit CT-2A-Zellen, dass die Behandlung mit Amph-FITC/CAR T die tumorspezifischen endogenen T-Zell-Reaktionen im Vergleich zu unbehandelten tumortragenden Mäusen verstärkte, obwohl der Amph-FITC-Impfstoff hinzugefügt wurde Die Auffrischung schien gegenüber der alleinigen Verabreichung von Amph-FITC keinen zusätzlichen Nutzen zu bringen.

Ermutigt durch den Beweis, dass die Amph-FITC/CAR-T-Behandlung eine endogene T-Zell-Primierung auslöst, untersuchten wir als Nächstes, ob diese lokalisierte Therapie systemische Antitumor-Immunreaktionen auslösen könnte. Zu diesem Zweck implantierten wir CT-2A-Tumoren beidseitig in die Flanken von Mäusen und behandelten nur den rechten Flankentumor durch Verabreichung von Amph-FITC (in Kombination mit einer Amph-FITC-Impfung, Abb. 6a). Bemerkenswerterweise zeigten sowohl die injizierten (1°) als auch die nicht injizierten (2°) Tumoren eine deutlich verlangsamte Progression und das Gesamtüberleben der behandelten Tiere war deutlich verbessert (Abb. 6b, c). Anschließend testeten wir die Fähigkeit der lokalen Amph-FITC-Verabreichung, eine systemische Immunität gegen B16F10-Melanome hervorzurufen. Bei diesem aggressiveren Modell wurde der nicht injizierte Sekundärtumor mehrere Tage nach dem zu behandelnden Primärtumor inokuliert, um der endogenen T-Zell-Reaktion Zeit zu geben, sich zu entwickeln, bevor der distale Tumor ausufert (Abb. 6d). Die Injektion nur des Primärtumors führte zu einem verlangsamten Wachstum des behandelten Tumors und einem Trend zu einem verlangsamten Fortschreiten der unbehandelten Läsionen, zusätzlich zu einer signifikanten Steigerung des Gesamtüberlebens gegenüber unbehandelten Tieren (Abb. 6e, f). Somit führt die endogene T-Zell-Antwort, die durch die lokale Umleitung von CAR-T-Zellen mit Amph-FITC-Injektion initiiert wird, zu einem Immunangriff auf distale unbehandelte Tumoren.

a–c, C57BL/6-Mäuse (unbehandelt n = 10, behandelt n = 8) wurden mit CT-2A-Tumorzellen auf gegenüberliegenden Flanken geimpft und dann mit FITC-CAR-T-Zellen, Amph-FITC-Impfung und nur Amph-FITC behandelt in der 1°-Läsion. Gezeigt werden der Zeitplan und das Schema der Behandlung (a), die mittlere Tumorgröße (b) und das Gesamtüberleben (c) im Zeitverlauf. Erstellt mit Biorender.com. d–f, C57BL/6-Mäuse (n = 10 pro Gruppe) wurden mit B16F10-Tumorzellen auf gegenüberliegenden Flanken geimpft, dann mit FITC-CAR-T-Zellen, Amph-FITC-Impfung und It-Amph-FITC nur in der 1°-Läsion behandelt. Dargestellt sind der Zeitverlauf der Behandlung (d), die mittlere Tumorgröße (e) und das Gesamtüberleben (f) im Zeitverlauf. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Alle Replikate sind biologische Replikate. Die P-Werte wurden durch Zwei-Wege-ANOVA (Tumorwachstumskurven) und Log-Rank-Test (Mantel-Cox) (Überlebenskurven) bestimmt. NS, nicht signifikant; **P < 0,01; ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Quelldaten

Wir konzentrierten unsere ersten Studien auf immunkompetente Mausmodelle mit murinen CAR-T-Zellen, um die Analyse der Antigenausbreitung und der endogenen T-Zell-Immunität zu ermöglichen. Aber auch die Fähigkeit der Amph-FITC-Markierung, menschliche CAR-T-Zellen effektiv gegen menschliche Krebszellen umzulenken, war wichtig zu bewerten . Zu diesem Zweck haben wir FITC-spezifische CARs entwickelt, die in menschlichen T-Zellen stark exprimiert wurden (Abb. 7a). In vitro zeigten menschliche CAR-T-Zellen, die entweder mit hochaffinen 4m5.3- oder niedrigeraffinen E2-scFv-basierten CARs hergestellt wurden, eine starke Zytotoxizität gegenüber amph-FITC-markierten menschlichen MSTO-211H-Mesotheliomtumorzellen, unabhängig von der Verwendung von CD28 oder 4 -1BB co-stimulierende Domänen (Extended Data Abb. 5a). Somit erkennen menschliche CAR-T-Zellen auch Amph-FITC-beschichtete Krebszellen effektiv.

a, Ausdruck humanisierter FITC-CARs. b, Schema und Zeitplan der Therapie bei NSG-Mäusen. Erstellt mit Biorender.com. c,d, Biolumineszenzbildgebung (c) und Quantifizierung (d) des FLuc+ CAR T-Zellhandels in NSG-Mäusen (n = 5 Tiere pro Gruppe). e, MSTO-211H-Tumorwachstum von NSG-Mäusen nach Behandlung mit E2-hBBz-CAR-T-Zellen (n = 10 Tiere pro Gruppe). Alle Replikate waren biologische Replikate. Die P-Werte wurden durch Zwei-Wege-ANOVA bestimmt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. **P < 0,01; ***P < 0,001. NS, nicht signifikant.

Quelldaten

In den meisten unserer Studien zur Behandlung von syngenen murinen Tumoren haben wir Amph-FITC zusammen mit subkutan (sc) verabreichtem Amph-FITC (mit Adjuvans) verabreicht, das als Impfverstärker effizient in die Drainage von LNs aufgenommen wird21. Da jedoch Lymphgefäße und periphere LNs in den immundefizienten NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)-Mäusen, die für die Bewertung menschlicher CAR-T-Zellen verwendet werden, defekt sind, waren wir auf die Stimulierung FITC-spezifischer CAR-T-Zellen durch Amph-FITC beschränkt. Um die In-vivo-Aktivität von CAR-T-Zellen zu testen, die auf Amph-FITC-beschichtete Tumoren reagieren, inokulierten wir NSG-Mäuse mit MSTO-211H-Tumoren und adoptierten adoptiv übertragene Luciferase-exprimierende 4m5.3- oder E2-CAR-T-Zellen mit CD28- oder 4-1BB-Co-Zellen. stimulierende Domänen 7 Tage später und behandelte die Tiere dann mit wiederholten Dosen davon amph-FITC (Abb. 7b). Im Gegensatz zu murinen CAR-T-Zellen, bei denen der Transfer einer reinen CD8+-CAR-T-Zellpopulation eine bessere therapeutische Wirksamkeit als eine gemischte Population aus CD4+- und CD8+-CAR-T-Zellen aufwies, stellten wir fest, dass menschliche CAR-T-Zellen als gemischte CD4+- und CD8+-Zellen stärker proliferierten Population nach Amph-FITC-Verabreichung (Extended Data Abb. 5b), im Einklang mit früheren Studien38,39. Daher haben wir für Experimente mit menschlichen T-Zellen eine gemischte CD4/CD8-Population verwendet. Die Analyse der CAR-T-Zellen nach dem adoptiven Transfer zeigte, dass diese menschlichen CAR-T-Zellen aus einer Mischung aus Effektor-Gedächtniszellen (Tem) und Effektor-Gedächtniszellen bestanden, die CD45RA-Phänotypen (Temra) erneut exprimierten (Extended Data Abb. 5c, d).

Bei der Behandlung von Tumoren wie in Abb. 7b zeigten alle CAR-T-Zellen zwischen Tag 13 und Tag 25 ein gewisses Maß an Akkumulation in Tumoren, aber E2-h28z- und E2-hBBz-CAR-T-Zellen zeigten die stärkste Akkumulation an den injizierten Tumorstellen ( Abb. 7c,d). Die Zählung der CAR-T-Zellen in der Milz am Tag 40 zeigte auch die systemische Persistenz aller CAR-T-Zellen, mit Ausnahme der 4m5.3-h28z-CAR-T-Zellen, die als reine CD8+-Population infundiert wurden (Extended Data, Abb. 5e). Aufgrund seiner höheren Expression, überlegenen In-vitro-Tumorzytotoxizität und robusten Akkumulation in Tumoren haben wir das E2-hBBz-CAR-Konstrukt für Studien zur Therapie menschlicher T-Zellen weiterentwickelt. In Kombination mit amph-FITC führten E2-hBBz-CAR-T-Zellen bei etwa 20 % der Mäuse zu einer vollständigen Tumorabstoßung und bei weiteren 60 % der Kohorte wurde das Tumorwachstum gestoppt (Abb. 7e). Während der Behandlung wurden keine offensichtlichen Toxizitäten in Form von Gewichtsverlust oder Verhaltensänderungen der Tiere festgestellt, bis zu einem späteren Zeitpunkt sowohl die behandelten als auch die unbehandelten Gruppen begannen, Symptome der Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD) zu zeigen, einer bekannten Einschränkung des NSG-Mausmodells. Bemerkenswert ist, dass die durch die Amph-FITC-Behandlung induzierte 13,3-fache relative Expansion der CAR-T-Zellen (Extended Data Abb. 5f) die GVHD in dieser Gruppe verschlimmerte, was zum frühen Tod einer Reihe von Tieren führte, die auf die Behandlung ansprachen (Abb. 7e). ). Daher scheint die Injektion von Amph-FITC eine vielversprechende Strategie zu sein, um menschliche CAR-T-Zellen gegen solide Tumoren zu lenken.

Bisher wurde die Übertragung der CAR-T-Zelltherapie auf solide Tumoren durch die unvollkommene Natur der Tumorantigene eingeschränkt, wobei eine heterogene Antigenexpression und eine schlechte Tumorspezifität zu Behandlungsresistenz bzw. Toxizität für gesundes Gewebe führen8,9,10,11. Hier beschreiben wir eine Therapie mit einem Phospholipid-Polymer-Konjugat, das, wenn es lokal durch seine Injektion verabreicht wird, Zellen innerhalb des Tumors mit einem kleinen Molekülantigen, FITC, markiert und Krebszellen für die Zerstörung durch FITC-spezifische CAR-T-Zellen markiert. Diese Behandlung verlängerte das Überleben bei mehreren syngenen soliden Maustumoren und löste auch eine Tumorregression in einem humanen Xenotransplantatmodell für solide Tumoren aus. Wichtig ist, dass die durch Amph-FITC gesteuerte CAR-T-Zytotoxizität die Freisetzung von Tumorantigenen und die Aktivierung von DCs auslöste, was zum Priming endogener Antitumor-T-Zellen führte. Diese endogene Immunität reichte aus, um vor einer erneuten Tumorinfektion zu schützen, und stellt einen Mechanismus für einen endogenen Immunangriff gegen nicht injizierte Läsionen dar.

Diese Strategie ermöglicht die Kontrolle des Tumor-Targetings durch lokale IT-Verabreichung von Amph-FITC und stellt sicher, dass CAR-T-Zellen Krebszellen effektiv erkennen können, während gleichzeitig die On-Target-Toxizität außerhalb des Tumors an distalen gesunden Geweben begrenzt wird. In früheren Studien wurden FITC-spezifische CAR-T-Zellen verwendet und diese Zellen gegen Tumore gerichtet, indem FITC mit auf den Tumor gerichteten Antikörpern55,56,57 oder Metaboliten wie Folat58,59,60 verknüpft wurde. Die größte Einschränkung solcher Ansätze besteht jedoch darin, dass uns bei den meisten soliden Krebsarten geeignete Zielantigene für die Erzeugung solcher Schalter fehlen. FITC-CAR-T-Zellen wurden mithilfe von an FITC gekoppelten Anti-CD19- oder Anti-CD20-Antikörpern gegen Tumore gerichtet55,56, aber diese Antigene werden nur auf einer Untergruppe von Leukämien und Lymphomen exprimiert, und wir haben bereits wirksame CAR-T-Zellprodukte zugelassen diese Einstellung. Mehrere Studien haben FITC-CAR-T-Zellen mithilfe des an FITC gekoppelten HER2-Targeting-Antikörpers Trastuzumab umgeleitet55,57, aber in der Klinik wurde gezeigt, dass Trastuzumab-basierte CAR-T-Zellen aufgrund der geringen Expression bei Patienten möglicherweise tödliche Toxizität haben von HER2 auf Lungenepithelzellen9. Dies ist ein allgemeines Problem bei tumorassoziierten Antigenen wie HER2, EGFR und Folatrezeptor. Trotz intensiver Bemühungen auf dem Gebiet der CAR-T-Zell- und Antikörpertherapie ist die Identifizierung breit zielbarer und wirklich tumorspezifischer Zelloberflächenantigene bisher weitgehend gescheitert. Selbst wenn Targeting-Liganden wie FITC-konjugierte Antikörper, wie hier durchgeführt, intratumoral injiziert würden, um diese Bedenken auszuräumen, stehen sie außerdem vor der zusätzlichen Herausforderung, dass die Tumorantigenexpression selbst innerhalb eines bestimmten Tumortyps (wie EGFRvIII beim Glioblastom) von Patient zu Patient stark variieren kann11 ).

Hier zeigen wir einen völlig Tumorantigen-agnostischen Ansatz, der nicht auf der Identifizierung krebszellspezifischer Oberflächenantigene beruht. Darüber hinaus sollte die Membraninsertion durch amph-FITC eine gleichmäßige CAR-T-Zell-Umleitung gegen Tumore bei allen Patienten und Tumortypen ermöglichen und so die Herausforderung der Heterogenität der Antigenexpression bewältigen. Obwohl Krebszellen in der Lage sind, durch Mutation oder Herunterregulierung des Zielantigens eine Resistenz gegen eine adoptive Zelltherapie zu entwickeln, die auf nativ exprimierte Proteine ​​abzielt, gehen wir davon aus, dass solche Resistenzmechanismen bei der Insertion von CAR-Ligandenmembranen viel schwieriger sein werden. Wie wir zuvor gezeigt haben21, ist der Prozess der Amph-Liganden-Markierung hochgradig modular; Obwohl diese Studie mit FITC als Modellantigen durchgeführt wurde, könnte FITC gegen eine Reihe anderer Liganden ausgetauscht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ein Protein- oder Peptidantigen oder andere kleine Moleküle. Der amph-FITC-Ligand ist eine einfache und wohldefinierte molekulare Einheit, die sich leicht für die GMP-Herstellung eignet. Ligandenspezifische CAR-T-Zellen können mithilfe vorhandener Arbeitsabläufe entwickelt und erweitert werden, ohne dass Änderungen an der viralen Vektorproduktion oder der Ex-vivo-T-Zellkultur erforderlich sind. Das Lipidpolymer DSPE-PEG ist ein zentraler Bestandteil zugelassener Arzneimittel wie Doxil61 mit einem etablierten Sicherheitsprofil. Darüber hinaus würde bei Bedarf eine Kombinationstherapie mit einem Amph-Liganden-Impfstoff nahtlos erfolgen und lediglich die Zugabe eines geeigneten Impfstoffadjuvans, wie des hier verwendeten STING-Agonisten, erfordern.

Es gibt Belege für die Fähigkeit der CAR-T-Zell-vermittelten Zytotoxizität, eine Antigenausbreitung in syngenen murinen soliden Tumormodellen auszulösen21,22,23,24,25, selbst wenn LD-Therapien vor dem adoptiven Transfer eingesetzt werden. Obwohl die Evidenz bei Patienten begrenzter war, wurde über die Induktion neuartiger Antikörperreaktionen nach einer CAR-T-Zelltherapie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs berichtet62, und ein Fallbericht eines Patienten, der wegen metastasiertem Rhabdomyosarkom mit HER2-CAR-T-Zellen behandelt wurde, dokumentierte die oligoklonale Expansion endogener T-Zellen63 , was auf eine Antigenausbreitung hindeutet. Hier fanden wir heraus, dass die CAR-T-Erkennung des in die Membran eingeführten Amph-Liganden eine signifikante Ausweitung der endogenen Antitumor-T-Zell-Antwort hervorrief, die geheilte Mäuse vor einer erneuten Belastung mit Elternkrebszellen in Abwesenheit des CAR-Liganden schützte und eine Antitumoraktivität gegen distale Läsionen induzierte.

Ein potenzieller Nachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit einer lokalen Injektion von Amph-Liganden. Obwohl dies die Anwendung der Therapie auf zugängliche Tumoren einschränken kann, werden Immuntherapien immer häufiger eingesetzt, wobei die entsprechende Anzahl klinischer Studien exponentiell zunimmt64,65. Mit der Entwicklung zusätzlicher IT-Therapien werden auch die Technologien zur Verabreichung dieser Wirkstoffe (z. B. bildgesteuerte Injektionen) weiterentwickelt und breiter eingesetzt66. Während viszerale Tumoren für Injektionen zugänglich sind, sind wiederholte Injektionen möglicherweise weniger durchführbar, und wir untersuchen aktiv die Mindestanzahl an Injektionen, die erforderlich ist, um eine Tumorrückbildung durch Amph-FITC/CAR-T-Therapie zu induzieren, und gehen davon aus, dass nur zwei bis drei Injektionen möglich sein werden ausreichen. Wir fanden heraus, dass eine Behandlung einmal alle 6 Tage genauso wirksam war wie eine Dosierung alle 3 Tage (Extended Data Abb. 3a). Insbesondere wird die von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassene onkolytische Virusimmuntherapie Talimogen Laherparepvec mindestens 6 Monate lang alle zwei Wochen nach der ersten Dosierung verabreicht.

Ein weiteres Problem besteht darin, dass die Amph-Ligand-Dekoration alle Zellpopulationen und nicht nur Krebszellen dekoriert. Wir haben gezeigt, dass LD-Vorbehandlungen, die üblicherweise vor dem CAR-T-Zelltransfer durchgeführt werden, bereits den Großteil der Immunzellen entfernen, was die Besorgnis über die Umleitung von CAR-T-Zellen gegen Infiltrate von Wirts-Immunzellen verringert. Darüber hinaus sind IT-Zellpopulationen wie tumorassoziierte Makrophagen, myeloische Zellen und krebsassoziierte Fibroblasten stark immunsuppressiv und tumorfördernd, und in vielen anderen Studien wurde gezeigt, dass ihre Eliminierung die Antitumor-Immunantwort vorantreibt67,68,69,70,71 . Daher würden die Amph-FITC-Dekoration und die CAR-T-vermittelte Abtötung dieser Wirtszellpopulationen wahrscheinlich die Tumorabstoßung fördern, anstatt eine Toxizität darzustellen.

Zusammenfassend haben wir eine vollständig tumoragnostische universelle CAR-T-Zelltherapie gezeigt, die auf der Membraninsertion intratumoral verabreichter Amphliganden basiert. Dieser Ansatz zeigte eine starke Antitumoraktivität gegen mehrere Tumortypen und bei immunkompetenten Wirten. Bemerkenswerterweise induzierte die Amph-Liganden-gesteuerte CAR-T-Zelltherapie auch eine endogene T-Zell-Antwort. Obwohl die CAR-T-Zelltherapie bei der Bekämpfung von Leukämien und Lymphomen, die allgegenwärtige Antigene wie CD19 exprimieren, eine beeindruckende Wirksamkeit gezeigt hat, stellt die Verabreichung von Amph-CAR-Liganden eine Strategie für die universelle Behandlung solider Tumoren dar, bei denen die Auswahl der Tumorantigene problematischer ist, was den Patienten erheblich belastet Population, die von einer adoptiven Zelltherapie profitieren könnte.

DSPE-PEG-FITC (PEG MW 1, 2, 3,4 und 5 kDa) wurde von Creative PEGworks erworben (Kat.-Nr. PLS-9926 bis 9929). DSPE-FITC und DSPE-PEG10k-FITC wurden von Nanosoft Polymers (Kat.-Nr. 10805) bzw. Nanocs (Kat.-Nr. PG2-DSFC-10k) erworben. Cyclic di-GMP wurde von Invivogen bezogen.

Phoenix-ECO-, B16F10- und MSTO-211H-Zellen wurden von ATCC gekauft. 293T-Zellen wurden von Clontech gekauft. MC38- und CT-2A-Luc-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Dane Wittrup vom Massachusetts Institute of Technology (MIT) bzw. Dr. Thomas Seyfried vom Boston College zur Verfügung gestellt. CT-2A- und MSTO-211H-Zellen wurden lentiviral transduziert, um murines EGFRvIII und tdTomato bzw. menschliches Mesothelin stabil zu exprimieren, mit Selektion unter Verwendung von Puromycin und Sortierung auf einem BD FACSAria III Cell Sorter. B16F10-, CT-2A-, MC38-, 293T- und Phoenix-ECO-Zellen wurden in komplettem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (Cytiva; ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U ml–1 Penicillin und 100 mg ml–1 Streptomycin) kultiviert. MSTO-211H-Zellen wurden in vollständigem Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Cytiva) kultiviert.

Alle murinen CARs enthielten das CD8α-Signalpeptid (MALPVTALLLPLALLLHAARP), gefolgt von einem Myc-Tag (EQKLISEEDL, zur Analyse der Zelloberflächenexpression) und einem FITC-spezifischen scFv, abgeleitet vom monoklonalen Antikörperklon 4m5.3 (Ref. 36), E2 (Ref . 37) oder E2 mit einer His-H58-Ala-Mutation72 („E2.7“). Extrazelluläre Domänen wurden mit den CD8α-Gelenk- und Transmembrandomänen, den kostimulatorischen CD28- oder 4-1BB-Domänen und einer intrazellulären CD3ζ-Domäne fusioniert und in einen retroviralen pMIG-Vektor kloniert. Für Biolumineszenz-Bildgebungsstudien wurden T-Zellen mit MI-FLuc-IRES-mCherry co-transduziert, einem Geschenk von Xiaoping Sun (Addgene-Plasmid #75020; http://n2t.net/addgene:75020; RRID: Addgene_75020). Alle humanisierten CARs wurden auf ähnliche Weise wie oben unter Verwendung humanisierter Domänen geklont, mit der Ausnahme, dass CARs, die co-stimulierende CD28-Domänen enthielten, mit einer CD28-Transmembrandomäne gepaart wurden. Humanisierte CARs wurden unter der Kontrolle eines Cytomegalievirus-Promotors in den lentiviralen Vektor pLenti6.3 (ThermoFisher) kloniert. Für Biolumineszenz-Bildgebungsstudien wurden T-Zellen mit pCDH-EF1-Luc2-P2A-tdTomato, einem Geschenk von Kazuhiro Oka (Addgene-Plasmid #72486; http://n2t.net/addgene:72486; RRID: Addgene_72486), co-transduziert ). Die Expression aller CARs wurde durch durchflusszytometrische Färbung des Myc-Tags unter Verwendung eines Anti-Myc-Tag-Antikörpers (9B11, PE-Konjugat, Cell Signaling) mit Analyse auf einem BD LSR-II-Durchflusszytometer bestimmt.

Um ein ökotropes Retrovirus für die Transduktion muriner T-Zellen zu produzieren, wurden Phoenix-ECO-Zellen mit einem 1:3-Verhältnis von pCL-Eco und Transferplasmid unter Verwendung eines CalPhos Mammalian Transfection Kit (Takara Bio) transfiziert. Primäre Maus-T-Zellen wurden aus der Milz von WT- oder CD45.1+ C57BL/6-Mäusen unter Verwendung des EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit oder des EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (StemCell Technologies) isoliert und 48 Stunden lang auf Nicht-Mäusen mit sechs Vertiefungen aktiviert. Mit Gewebekultur (TC) behandelte Platten, vorbeschichtet mit 0,5 mg ml-1 Anti-CD3 (BioXCell, Klon 2C11) und 5 mg ml-1 Anti-CD28 (BioXCell, Klon 37.51) bei 106 Zellen ml-1 mit 5 ml pro Vertiefung . T-Zellen wurden in vollständigem RPMI mit 1 mM Natriumpyruvat, 0,05 mM β-Mercaptoethanol und 1 × minimalem essentiellen Medium mit nicht-essentiellen Aminosäuren (ThermoFisher), ergänzt mit 10 ng ml murinem IL-2 (BioLegend), kultiviert. Nach der Aktivierung wurden T-Zellen durch Spinfektion mit 3 × 106 Zellen pro Vertiefung in vollständigem T-Zellmedium für 90 Minuten bei 1.100 g und 32 °C mit 10 ng ml–1 Polybrene (Sigma) auf nicht mit TC behandelten Platten transduziert. beschichtet mit 15 mg ml−1 RetroNectin (Takara Bio). Die CAR-Expression wurde 24 Stunden nach der Transduktion mittels Durchflusszytometrie getestet. T-Zellen wurden bei einer Zelldichte von 106 Zellen ml-1 gehalten und dann 48 Stunden nach der Transduktion für adoptive Transfers oder In-vitro-Tests verwendet.

Für humanisierte CARs wurde das G-pseudotypisierte Lentivirus des vesikulären Stomatitisvirus durch Transfektion von 293T-Zellen mit psPAX2, pMD2.G und Transferplasmid im Verhältnis 2:1:2 unter Verwendung von Effectene Transfection Reagent (QIAGEN) hergestellt. Primäre menschliche T-Zellen wurden aus Leukozytenfilmen von gesunden Spendern (Massachusetts General Hospital Blood Donor Center) mit dem EasySep Human CD8+ T Cell Isolation Kit oder dem EasySep Human T Cell Isolation Kit (StemCell Technologies) isoliert und 48 Stunden lang mit Dynabeads Human T-Cell aktiviert. Aktivator CD3/CD28 (ThermoFisher) im Verhältnis 3:1 Perlen zu Zellen. Menschliche T-Zellen wurden in vollständigem RPMI, ergänzt mit 30 U ml−1 menschlichem IL-2 (PeproTech), kultiviert. Nach der Aktivierung wurden T-Zellen wie oben beschrieben transduziert und gefärbt und 48–72 Stunden nach der Transduktion für adoptive Transfers oder In-vitro-Studien verwendet.

Zur In-vitro-Markierung von Tumorzellen mit Amph-FITC wurden Tumorzellen mit 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und bei einer Zelldichte von 106 Zellen ml−1 für 30 Minuten bei 37 °C mit DSPE-PEGx- inkubiert. FITC, wobei x = 0, 1, 2, 3,4 oder 10 kDa (Creative PEGworks) in PBS. Für Co-Kulturen wurden die Zielzellen gleichzeitig mit 100 nM Amph-FITC und CellTrace Violet (ThermoFisher) markiert; 20.000 Zielzellen wurden pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden mit CAR-T-Zellen in den angegebenen E:T-Verhältnissen ausgesät. Nach einer 16-stündigen Inkubation wurden die Zellen zur Durchflusszytometrie mit SYTOX-Rot (ThermoFisher) gefärbt und IFN-γ im Überstand unter Verwendung eines unbeschichteten Maus-IFN-gamma-ELISA-Kits (Invitrogen) quantifiziert.

Um die Bioverteilung von Amph-FITC nach seiner Injektion zu beurteilen, wurden C57BL/6-Mäuse (6–8 Wochen, Jackson Laboratory, n = 5) sc mit 106 B16F10-Tumorzellen geimpft. Sobald die Tumoren eine Fläche von etwa 25 mm2 hatten, wurden 10 nmol DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks) intratumoral injiziert. Nach 24 Stunden wurden die Gewebe (Tumor, Leber, Niere, Milz, Knochenmark sowie axilläre und inguinale LNs) in Ethanol (pH 8,0–8,5) homogenisiert und die Fluoreszenz des Überstands auf einem FlexStation 3-Plattenlesegerät (Molecular Devices, Anregung 495) quantifiziert nm, Emission 519 nm).

Für zelluläre Lokalisierungsstudien wurden MC38-tumortragenden Mäusen intratumoral 10 nmol DSPE-PEG2k-FITC injiziert, und 24 Stunden später wurden die Tumore 30 Minuten lang bei 37 °C mit 1 mg ml−1 Kollagenase D und 0,2 mg ml− enzymatisch verdaut 1 DNase I in vollständigem RPMI-Medium vor der mechanischen Dissoziation durch ein 70-µm-Zellsieb. Die Proben wurden mit den folgenden Antikörpern gefärbt: PE-Cy7 Anti-CD45 (Klon 30-F11, BioLegend), BV605 Anti-CD11b (Klon M1/70, BioLegend), PE Anti-CD11c (Klon N418, BioLegend), BV711 Anti- Maus-CD3 (Klon 17A2, BioLegend), BV421-Anti-CD8α (Klon 53-6.7, BioLegend) und Alexa Fluor 647-Anti-FITC (Jackson ImmunoResearch) und wurden auf einem BD LSRFortessa-Durchflusszytometer analysiert.

Alle Tierversuche wurden im Rahmen der Tierpflege eines Instituts der Abteilung für Vergleichende Medizin des MIT durchgeführt, wobei ein vom Ausschuss für Tierpflege am MIT genehmigtes Tierprotokoll und ein vom Ausschuss genehmigtes Protokoll in Übereinstimmung mit Bundes-, Landes- und lokalen Richtlinien verwendet wurden.

C57BL/6 WT-, CD45.1+-, Batf3-Knockout- (KO) und Rag1-KO-Mäuse (Jackson Laboratory, 6–8 Wochen alt) wurden mit 106 B16F10-, 106 MC38- oder 3 × 106 CT-2A-Tumorzellen sc an der Flanke inokuliert . Sobald die Tumoren eine Fläche von etwa 25 mm2 erreichten, wurden die Mäuse 24 Stunden vor dem adoptiven Transfer von 107 CD45.1+ CAR-T-Zellen intravenös (iv) einer nicht-myeloablativen TBI-Dosis von 5 Gy unterzogen, die von einer [137Cs]-Gammastrahlungsquelle verabreicht wurde die Schwanzvene. Einen Tag später wurden die Mäuse sc an der Schwanzbasis mit 10 nmol DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks) und 25 µg zyklischem Di-GMP (Invivogen) geimpft und einmal wöchentlich mit drei Gesamtdosen geimpft. Die Injektion (it) von 10 nmol amph-FITC erfolgte ab dem Tag nach der ersten Impfung und wurde alle 3 Tage fortgesetzt.

Für Xenotransplantatstudien wurden 6 bis 12 Wochen alte NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)-Mäuse (Jackson Laboratory) mit 3 × 106 MSTO-211H-Zellen sc an der Flanke inokuliert. Sobald die Tumore auf etwa 25 mm2 angewachsen waren, wurden Mäuse adoptiv mit 107 CAR-T-Zellen iv über die Schwanzvene transferiert. Die Injektion (it) von 10 nmol amph-FITC erfolgte ab dem Tag nach dem adoptiven Transfer und wurde alle 3 Tage fortgesetzt.

In allen Studien wurde das Fortschreiten des Tumors durch Messschiebermessungen überwacht. Das Überleben wurde im Laufe der Zeit bewertet, bis die Tumoren eine Fläche von mehr als 200 mm2 hatten, nach mehr als einer Woche stark ulzeriert waren oder einen Gewichtsverlust von mehr als 20 % aufwiesen. Um den Transport von FLuc-exprimierenden CAR-T-Zellen zu überwachen, wurden Mäusen 150 mg kg−1 d-Luciferin-K+-Salz (Perkin-Elmer) sc am Genick injiziert und auf einem Xenogen IVIS Spectrum abgebildet. Vor der Bildgebung wurden C57BL/6-Mäuse auf dem Rücken enthaart, um die Signalempfindlichkeit zu verbessern.

Zur Quantifizierung muriner CAR-T- und endogener T-Zellen im peripheren Blut, im Tumor und in der Milz wurden die Gewebe durch ein 70-µm-Zellsieb homogenisiert (mit Ausnahme von MC38-Tumoren, die wie oben beschrieben eine enzymatische Verdauung erforderten). Blut- und Milzproben wurden mit ACK-Lysepuffer (Gibco) inkubiert, um mononukleäre Zellen des peripheren Blutes bzw. Splenozyten zu isolieren. Die Proben wurden dann mit PE-Anti-CD45.1 (Klon A20, BioLegend), BUV805-Anti-CD8α (Klon 53-6.7, BioLegend), Alexa Fluor 647-Anti-CD4 (Klon GK1.5, BioLegend) und APC-Cy7-Anti gefärbt -CD45.2 (Klon 104, BioLegend) und LIVE/DEAD Fixable Aqua (ThermoFisher) analysiert und auf einem BD LSRFortessa-Durchflusszytometer analysiert.

Für Antigenaufnahmestudien wurden Tumore und LNs mit Zombie Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend), BUV395 Anti-CD45 (Klon 30-F11, BD Biosciences), BV421 Anti-CD103 (Klon 2E7, BioLegend), BV605 Anti-Ly6C ( Klon HK1.4, BioLegend), BV711 Anti-F4/80 (Klon BMB, BioLegend), BV785 Anti-CD11b (Klon M1/70, BioLegend), Alexa Fluor 700 Anti-CD86 (Klon GL1, BioLegend), PE-Cy7 Anti-IA/IE (Klon M5/114.15.2, BioLegend), APC Anti-CD24 (Klon 30-F1, BioLegend), APC-Cy7 Anti-CD11c (Klon N418, BioLegend), PE-Cy5 Anti-CCR7 (Klon 4B12, BioLegend), PerCP-Cy5.5 Anti-CD169 (Klon 3D6.112, BioLegend) und BUV737 Anti-CD8α (Klon 53-6.7, BD Biosciences).

Zur Quantifizierung menschlicher CAR-T-Zellen im peripheren Blut, in der Milz und im Tumor wurden die Gewebe wie oben beschrieben verarbeitet und dann mit LIVE/DEAD Aqua, BUV496 Anti-CD4 (Klon SK3/Leu3a, BD Biosciences), BUV805 Anti-CD8α ( Klon SK1, BD Biosciences), PE-Anti-Myc-Tag (Klon 9B11, Cell Signaling) und APC-Cy7 Anti-CD45 (Klon 2D1, BioLegend).

Die Milzen wurden wie oben beschrieben verarbeitet. CT-2A- und B16F10-Zielzellen wurden 16 Stunden lang mit 100 U ml-1 bzw. 500 U ml-1 murinem IFN-γ (Abcam) vorbehandelt und dann mit 120 Gy mit einer [137Cs]-Gammastrahlungsquelle bestrahlt. Splenozyten (mehrere Verdünnungen, beginnend mit 106 Zellen pro Vertiefung) wurden 16 Stunden lang mit 25.000 Zielzellen pro Vertiefung kokultiviert, und ELISPOT wurde unter Verwendung eines Maus-IFN-γ-ELISPOT-Sets (BD Biosciences) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Gewebe (Tumor, Lunge, Leber und Niere) wurden 24 Stunden lang bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert. Für Immunfluoreszenzstudien wurden Tumore in 3 % Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur (Sigma-Aldrich) eingebettet, bevor sie auf einem Leica VT1000S-Vibratom in 100-µm-Schnitte verarbeitet wurden. Gewebeschnitte wurden mit 2 % Rinderserumalbumin und 0,2 % Triton-X 100 in PBS 1 Stunde lang bei 37 °C permeabilisiert, bevor sie 16 Stunden lang bei 37 °C mit Alexa Fluor 647- oder DyLight 405-konjugiertem Anti-FITC (Jackson ImmunoResearch) gefärbt wurden °C, gefolgt von mehreren PBS-Waschvorgängen. Die konfokale Mikroskopie wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Olympus FV1200 durchgeführt. Für die Immunhistochemie der Amph-FITC-Tumorverteilung wurden mit Paraformaldehyd fixierte Proben in Paraffin eingebettet und 10-µm-Schnitte erhalten. Die Schnitte wurden mit Anti-Myc-Tag (9B11, Cell Signaling) oder Anti-CD45.1 (A20, BioLegend) gefärbt. Für immunhistochemische Studien wurden Tumore in einer Mischung mit optimaler Schnitttemperatur eingefroren und auf einem Leica CM1950-Kryostat zu 14 μm dicken Schnitten verarbeitet. Gewebeschnitte wurden mit 2 % Rinderserumalbumin und 0,2 % Triton-X 100 in PBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur permeabilisiert, bevor sie mit biotinyliertem Anti-Trp1 (TA99) (Geschenk von Dr. Dane Wittrup am MIT), BV421-konjugiertem Streptavidin ( Biolegend), Alexa Fluor 647-konjugiertes Anti-FITC (Klon SPM395, Novus Biologicals) und CellMask Orange Plasma Membrane Stain (Invitrogen). Die Bildgebung wurde mit einem spektralen konfokalen Mikroskop Leica SP8 durchgeführt.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 9 durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Zur Beurteilung der statistischen Signifikanz wurden die folgenden Tests verwendet: zwischen zwei Gruppen ungepaarter zweiseitiger Student-T-Test oder Mann-Whitney-U-Test; für Mehrfachvergleiche bidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-Mehrfachvergleichen; für wiederholte Messungen über einen Zeitverlauf, Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen; für Kaplan-Meier-Überlebenskurven, Log-Rank-Test (Mantel-Cox). Alle P-Werte sind in den Abbildungen bzw. in deren Legenden angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage auch bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem Koch Institute Swanson Biotechnology Center für die technische Unterstützung, insbesondere für die Kerneinrichtungen für präklinische Bildgebung und Tests, Durchflusszytometrie, Mikroskopie und Histologie. Die Abbildungen 1a, 3a, 6a und 7b wurden mit Biorender.com erstellt. AQZ wurde durch die Auszeichnungsnummer T32GM007753 vom National Institute of General Medical Sciences unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise vom Marble Center for Cancer Nanomedicine, dem NIH (Auszeichnung CA247632), der Mark Foundation for Cancer Research, dem Ragon Institute of MGH, MIT und Harvard sowie dem Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 unterstützt vom National Cancer Institute. DJI ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute.

Koch-Institut für integrative Krebsforschung, Cambridge, MA, USA

Angela Q. Zhang, Alexander Hostetler, Laura E. Chen, Vainavi Mukkamala, Wuhbet Abraham, Lucia T. Padilla, Alexandra N. Wolff, Laura Maiorino, Coralie M. Backlund, Aereas Aung, Mariane Melo, Na Li, Shengwei Wu und Darrell J. Irvine

Abteilung für Gesundheitswissenschaften und Technologie, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Angela Q. Zhang

Abteilung für Biophysik, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Angela Q. Zhang

Abteilung für Biotechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Alexander Hostetler, Laura E. Chen, Vainavi Mukkamala, Lucia T. Padilla, Alexandra N. Wolff und Darrell J. Irvine

Ragon Institute of MIT, MGH und Harvard, Cambridge, MA, USA

Darrell J. Irvine

Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA

Darrell J. Irvine

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DJI und AQZ konzipierten das It-Amph-Liganden-Konzept und verfassten den Artikel. Von AQZ, AH, LEC, VM und DJI konzipierte Experimente. AQZ, AH, LEC, VM, WA, LTP und ANW führten In-vitro-Amph-FITC-Tagging- und Co-Kulturexperimente durch. AQZ, AH, LEC, LM und CMB führten In-vivo-Amph-FITC-Tagging-Experimente durch. AQZ, LEC, VM und WA führten In-vivo-Experimente zum Handel mit CAR-T-Zellen durch. AQZ, LM, AH und AA führten histologische Experimente durch. AQZ, AH, LEC, VM, WA, LTP, ANW, LM, CMB, MM, NL und SW führten in vivo therapeutische Studien in syngenen Modellen durch. AQZ und LTP führten In-vivo-Therapiestudien an menschlichen Xenotransplantat-Mausmodellen durch. AQZ, LEC und VM führten Experimente zur Epitopausbreitung durch.

Korrespondenz mit Darrell J. Irvine.

AQZ, AH, LEC und DJI haben einen vom MIT eingereichten Patentantrag im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit präsentierten Daten eingereicht. DJI ist Berater und Anteilseigner von Elicio Therapeutics, das Lizenzrechte am oben genannten geistigen Eigentum des MIT besitzt. Die anderen Autoren erklären keine Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Stephen Gottschalk, Donald O'Rourke und Masataka Suzuki für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a Zeitleiste der Therapie bei MC38-tumortragenden C57BL/6-Mäusen. b, c CAR-T-Zellen im peripheren Blut (b, Tag 4) und im Tumor (c, Tag 11) (n = 5 Tiere/Gruppe). Die p-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test bestimmt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Quelldaten

a Gruppen von C57BL/6-Mäusen mit B16F10-Tumoren (n = 5 Tiere/Gruppe) wurden mit 250 mg/kg Cyclophosphamid und 50 mg/kg Fludarabin, verabreicht einen Tag vor dem adoptiven Zelltransfer, lymphodepletiert, gefolgt von einer Behandlung mit intratumoralem Amph-FITC und Amph - FITC-Impfstoffauffrischung wie angegeben. b Vergleich des Tumorwachstums bei unbehandelten Mäusen (n = 7) mit Tieren, die sieben Tage nach der Inokulation mit 3 × 106 CT-2A-Zellen eine Lymphodepletionstherapie mit 5 Gy TBI (n = 8) erhielten. p-Werte wurden durch Zwei-Wege-ANOVA bestimmt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. ns, nicht signifikant; **p < 0,01.

Quelldaten

ein Vergleich von Tumorwachstum (links) und Überleben (rechts) bei CT-2A-tumortragenden Mäusen, die alle 3 oder 6 Tage mit CAR-T-Zellen und anschließendem intratumoralem Amph-FITC behandelt wurden (n = 5 Tiere/Gruppe). b Vergleich von Tumorwachstum (links) und Überleben (rechts) bei CT-2A-tumortragenden Mäusen, die mit FITC-CAR-T-Zellen behandelt wurden, die in mIL-2 oder einer Kombination aus mIL-7 und mIL-15 hergestellt wurden (n = 5 Tiere/Gruppe). ). Die P-Werte wurden durch Zwei-Wege-ANOVA (Tumorwachstumskurven) und Log-Rank-Test (Mantel-Cox) (Überlebenskurven) bestimmt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. ns, nicht signifikant; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Quelldaten

a Zeitleiste der Therapie bei CT-2A-tumortragenden C57BL/6-Mäusen. b Körpergewicht von B16F10-tumortragenden C57BL/6-Mäusen im Verlauf der Therapie (n = 5 Tiere/Gruppe). c, d Quantifizierung von Serumzytokinen (c, n = 5 Tiere/Gruppe) und Serum-ALT und AST (d, n = 7 Tiere/Gruppe) 3 und 12 Tage nach dem adoptiven Transfer. Die P-Werte wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA (Körpergewichtskurven) oder einen ungepaarten Student-t-Test bestimmt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (b) und der Standardabweichung (c) dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Quelldaten

a In-vitro-Zytotoxizität von FITC-CAR-T-Zellen mit amph-FITC+ MSTO-211H menschlichen Mesotheliomkrebszellen bei einem ET-Verhältnis von 1:1. b Vergleich des Luciferase-Signals von fLuc+ CAR T-Zellen über die Zeit bei Mäusen, die nur mit CD8+ 4m5.3-h28z CAR T-Zellen oder einer Kombination aus CD4+ und CD8+ CAR T-Zellen behandelt wurden (n = 5 Tiere/Gruppe). c, d Gating-Strategie zur Immunphänotypisierung menschlicher CAR-T-Zellen (c) und phänotypische Zusammensetzung von CAR-T-Zellen, die 23 Tage nach dem adoptiven Transfer aus der Milz von NSG-Mäusen gewonnen wurden (d, n = 5 Tiere/Gruppe). e Quantifizierung von CD4+- und CD8+-CAR-T-Zellen in der Milz am Tag 40 nach dem adoptiven Transfer (n = 5 Tiere/Gruppe). f Ganzmaus-Strahlung im Zeitverlauf als Ersatz für die CAR-T-Zellexpansion (n = 5 Tiere/Gruppe). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–5.

Quelldaten für alle Abbildungen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, AQ, Hostetler, A., Chen, LE et al. Universelle Umleitung von CAR-T-Zellen gegen solide Tumoren über membraninserierte Liganden für das CAR. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

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Eingegangen: 19. April 2022

Angenommen: 01. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

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